Deuxième génération d’harmoniques signaux dans la sclérotique de lapin comme un outil pour l’évaluation des thérapeutiques tissulaires réticulation (TXL) pour la myopie

Summary

Ce protocole décrit les techniques d’évaluation de réticulation chimique de la sclérotique de lapin à l’aide de l’imagerie de la génération de seconde harmonique et calorimétrie différentielle à balayage.

Abstract

Méthodes pour renforcer le tissu en introduisant des liaisons chimiques (réticulation non enzymatique) dans des protéines structurales (collagènes fibrillaires) pour la thérapie incluent la réticulation photochimique et tissus réticulation méthodes (TXL). Ces méthodes pour induire des changements de propriété tissu mécanique sont utilisées pour la cornée en amincissement cornéen (mécaniquement affaibli) troubles comme le kératocône, mais aussi la sclère dans la myopie progressive, où éclaircie et affaiblissement de la partie postérieure sclère se produit et contribue probablement à élongation axiale. Les protéines de la cible principale pour le renforcement de ces tissus sont des collagènes fibrillaires qui constituent la grande majorité des protéines de poids sec dans la cornée et la sclérotique. Fortuitement, collagènes fibrillaires constituent la principale source de deuxième génération harmonique de signaux dans l’espace extracellulaire du tissu. Donc, modifications des protéines de collagène, telles que celles induites par le biais de thérapies, la réticulation pourraient potentiellement être détectées et quantifiées par l’utilisation de la microscopie de génération d’harmoniques deuxième (SHGM). Surveillance SHGM signaux grâce à l’utilisation d’un laser à balayage système de microscopie couplée à une excitation infrarouge lumière source est une méthode d’imagerie moderne excitante qui jouit d’un usage répandu dans les sciences biomédicales. Par conséquent, la présente étude a été entreprise afin d’évaluer l’utilisation de la microscopie SHGM comme un moyen de mesurer a provoqué des effets réticulation dans ex vivo de sclère lapin, après une injection d’un produit chimique, agent de réticulation dans l’espace de la sub-Tenon (sT), un injection l’approche c’est une pratique courante pour causer d’anesthésie oculaire lors de procédures cliniques ophtalmologiques. Le produit chimique, agent de réticulation, hydroxyméthylglycinate de sodium (SMG), provient d’une classe de conservateurs cosmétiques appelée formaldéhyde libérant des agents (FAR). Sclérales changements après réaction avec SMG a entraîné une augmentation dans les signaux de la SHG et en corrélation avec des changements dans la température de dénaturation thermique, une méthode standard pour évaluer induite tissu effets de réticulation.

Introduction

Myopie progressive est postulée pour être traitable par réticulation sclérale non enzymatique (photochimique et/ou chimiques), ce qui est logique étant donné que le blocage enzymatique réticulation de collagène peut augmenter la privation (FD) de forme expérimentale-induite ¹de myopie. Elsheikh et Phillips² a récemment examiné la faisabilité et le potentiel d’utilisation standard irradiation ultraviolets A (UVA)-riboflavine médiée par réticulation photochimique (également connu sous le nom du protocole de Dresde), en abrégé ici comme (riboflavine CXL) pour une stabilisation sclérale postérieure stopper une élongation axiale dans la myopie. Cette méthode photochimique a été utilisée avec succès pour traiter la déstabilisation de la surface antérieure de globe (c.-à-d., la cornée bombée) vue dans keratectasia kératocône et post-LASIK. Cependant, application du présent protocole CXL pour la sclère est entravée par questions liées aux difficultés d’accès à la sclère postérieure avec une source de lumière ultraviolette (UV), ainsi que la nécessité de modifier une beaucoup plus grande tissu surface. Qu’étant dit, l’approche CXL a été utilisé pour stopper l’élongation axiale sous forme visuellement privé lapins (par tarsorrhaphy), bien que plusieurs régions de la sclère postérieure tenu plusieurs zones distinctes de l’irradiation dans cette étude³. En revanche, l’injection d’un agent stabilisant chimique (p. ex., agent de réticulation) par l’intermédiaire de l’espace sT pourrait représenter un moyen plus simple de modifier la sclère postérieure, évitant la nécessité d’introduire une source de lumière UV. Cette technique d’injection est bien connue comme un moyen utile d’induire une anesthésie oculaire durant les interventions ophtalmologiques tels que cataracte chirurgie^4,5,6. Wollensak⁷ a décrit précédemment l’utilisation d’une injection de sT à l’aide de glycéraldéhyde (un réticulation agent chimique semblable au concept de la formaldéhyde libérant des agents (FARs) décrites dans la présente étude) pour raidir le lapin sclérotique et la genipin a été montré pour limiter la longueur axiale en FD cobayes^8,9. Ces chercheurs ont démontré un net avantage de l’utilisation d’un agent chimique soluble sur la technique CXL photochimique. Ainsi, sclérale réticulation à l’aide d’un agent chimique injectable d’un certain type, y compris le FARs (c.-à-d., TXL)¹⁰, pourrait fournir une méthode de traitement possible pour stopper la progression de l’élongation sclérale vue dans la myopie.

Dans les protocoles présentés ici, nous utilisons la solution réticulation chimique de sodium hydroxyméthylglycinate (SMG), administrée par injection de sT à la sclérotique des yeux de lapin provenant de cadavres. Nous avons mis en place des protocoles similaires précédemment pour la réticulation chimique topique dans la cornée. Notamment dans les études rapportées antérieurement, dépendante de réticulation des effets de la concentration pourrait être obtenue en utilisant des SMG, avec une gamme d’effet couvrant bien supérieure à celle possible avec des procédés photochimique CXL tel que déterminé par l’analyse de la dénaturation thermique¹¹ .

Nous décrivons ici les protocoles visant à évaluer l’effet de réticulation de SMG envoyée via des injections de sT au tissu scléral, dénaturation thermique à l’aide de la calorimétrie à balayage différentielle (DSC) et deuxième de microscopie du génération harmonique (SHGM).

À l’aide d’analyse calorimétrique différentielle (DSC), également connu sous le nom de l’analyse thermique, une transition de dénaturation thermique est mesurée, qui pour tissu scléral est principalement guidé par les propriétés des collagènes fibrillaires, car ils constituent la majorité de vrac de la protéine. Cette méthode évalue la stabilité de la structure moléculaire de collagène et des liaisons réticulés qui stabilisent les fibrilles de collagène, la structure de la principale protéine tertiaire. Durant le chauffage dans le DSC, une température de transition critique est atteint qui entraîne la dénaturation de la molécule de collagène, entraînant dans le déroulement de la triple hélice, un processus qui se forme à ce qui est communément appelé gélatine. Cette dénaturation thermique perturbe les liaisons hydrogène le long de la molécule de collagène et peut être déplacée à des températures plus élevées par le biais de méthodes de réticulation induit^12,13. Cette méthode a été utilisée pendant de nombreuses décennies, particulièrement dans l’industrie des biomatériaux et des processus qui incluent la fabrication de cuir. Toutefois, cette méthode nécessite l’extraction du tissu sclérotique et ne peut donc être utile comme technique d’ex vivo .

Microscopie (SHGM) de la génération de seconde harmonique est basée sur les propriétés optiques non linéaires des matériaux particuliers, avec des environnements moléculaires non-centrosymétriques. Dans ces matières, lumière intense, par exemple lumière produit par laser, génère des signaux SHG, dans laquelle la lumière incidente est doublée en fréquence. Matières biologiques qui sont connus pour créer des signaux SHG sont le collagène, microtubules et myosine du muscle. Par exemple, le collagène excités par une lumière infrarouge de longueur d’onde de 860 nm émet un signal SHG dans le domaine du visible avec la longueur d’onde de 430 nm. Génération de seconde harmonique (SHG) signal imagerie est une méthode prometteuse pour l’évaluation de réticulation du collagène thérapeutique. On sait depuis plus de 30 ans que les fibrilles de collagène dans les tissus émettent SHG signaux¹⁴. Cependant, seulement récemment des images haute résolution pu¹⁵ dans une variété de tissus, y compris le tendon¹⁶, peau, cartilage,¹⁷,¹⁸de vaisseaux sanguins et collagène gels¹⁹.

Basé sur cette connaissance, cette étude évalue les changements de signal SHG induits dans la sclérotique par SMG induite chimiquement la réticulation du collagène. Les résultats indiquent que la modification de SMG de la sclère augmente les signaux SHG produites à partir de faisceaux de fibres de collagène des tissus (la plus haut ordre structure quaternaire composée de fibrilles de collagène) et produit également un changement structurel morphologique dans le collagène réseau de fibres optiques, reflété dans la fibre bundle « redressement. »

Protocol

Toutes les procédures ont été effectuées à l’aide des yeux de lapin provenant de cadavres dans les têtes de lapin non consanguins intact. Tous les institutionnels et National des directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire ont été suivies. 1. préparation des Solutions Préparation de SMG pour TXL : Préparer 1 mL de concentration de 0,2 M de solution (NaHCO3) de bicarbonate de sodium solution à l’aide de 0,0165 g de NaHCO3 p…

Representative Results

Température de dénaturation thermique (Tm) comme une méthode d’essai pour évaluer TXL réticulation effet : Un total de 16 paires d’yeux de lapin ont été utilisées dans ces expériences pour la procédure TXL. Dans une première partie de cette étude, la localisation de réticulation effet induit par une seule injection de l’agent de réticulation SMG via sT espace dans la tête de lapin provenant de cadavres a été évaluée. Ce type d’expérience depui…

Discussion

Expériences ont montré des preuves à l’appui de l’utilisation de la microscopie de signal SHG comme une méthode d’évaluation de collagène réticulation des effets dans la sclérotique, évoquant la possibilité future d’utiliser cette technique comme un outil de suivi pour les traitements de réticulation qui cible les protéines de collagène. À noter, un instrument est déjà en usage clinique pouvant potentiellement capturer ce signal SHG. Bien que cet instrument a été conçu principalement pour l’i…

Materials

MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V	EMD Millipore, Massachusetts, USA		Double distilled, deionized water. – protocol step 1.1.1
Sodium hydroxymethylglycinate	Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA		Crosslinking reagent – protocol step 1.1.2
Injection needle with luer-lock syringe	BD Eclipse, NJ, USA		Syringe for sub tenon injection. – protocol step 2.1
Rabbit head	La Granja poultry	Outbred	Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. – protocol step 2.2
Tono-pen	Reichter Technologies Depew, NY		IOP measurements – protocol step 2.4
DSC 6000 Autosampler	Perkin-Elmer Waltham, MA, USA		Thermal denaturation analyzer – protocol step 7.4
Pyris software	Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA	Ver 11.0	protocol step 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm – protocol step 8.1.1.
GenTeal	Alcon, Fort Worth, TX	B000URVDQ8	Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation – 8.1.1
Chameleon Vision II	Coherent, Santa Clara,CA, USA		Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. – protocol step 8.1.11
AttoFluor cell chamber	Thermo Fisher Scientific Inc	A7816	Fixation of the cover slip – protocol step 8.1.3
25-mm round coverslips, #1.5	Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA	GG-25-1.5	protocol step 8.1.3
Eclipse Ti-E	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		protocol step 8.1.4.
Non-descanned (NDD) GaAsP detector	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		Equipped with a 400-450 nm band pass filter – protocol step 8.1.7
A1R-MP laser scanning system	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. – protocol step 8.1.8
NIS Elements software	Nikon Instruments, Melville, NY, USA	Ver 4.3	refered to as "software" in the text – protocol step 8.1.9
Fiji/ImageJ	National Institute of Health		protocol step 9.1.2
NeuronJ	Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands		https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2
Microsoft Excel	Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA	Ver 14	protocol step 9.2.8