إشارات جيل التوافقي الثاني في أرنب الصلبة كأداة للتقييم للأنسجة العلاجي العابرة للربط (TXL) لقصر النظر
Summary
ويصف هذا البروتوكول تقنيات لتقييم المواد الكيميائية العابرة للربط من الصلبة أرنب باستخدام التصوير الجيل الثاني متناسق و فرق المسح القياس.
Abstract
وتشمل أساليب لتعزيز الأنسجة بإدخال روابط كيميائية (العابرة للربط غير الانزيمية) البروتينات الهيكلية (فيبريلار كولاجينس) للعلاج الضوئية العابرة للربط والأنسجة العابرة للربط (TXL) أساليب. تستخدم هذه الأساليب لإحداث تغييرات الخاصية الأنسجة الميكانيكية للقرنية في اضطرابات ترقق القرنية (أضعفت ميكانيكيا) مثل القرنية المخروطية، فضلا عن الصلبة في قصر النظر التقدمية، حيث ترقق وضعف الخلفي يحدث الصلبة والمرجح أن يساهم إلى استطالة محورية. البروتينات المستهدفة في المقام الأول لتعزيز مثل هذه الأنسجة هي كولاجينس فيبريلار التي تشكل الغالبية العظمى من البروتينات الوزن الجاف في القرنية والصلبة العينية. مصادفة، كولاجينس فيبريلار هي المصدر الرئيسي للإشارات جيل التوافقي الثاني في الفضاء خارج الخلية في الأنسجة. ولذلك يمكن أن يحتمل أن الكشف عن إدخال تعديلات على بروتينات الكولاجين، مثل تلك التي يتسبب فيها عن طريق العابرة للربط العلاجات، وكوانتيتاتيد عن طريق استخدام الفحص المجهري متناسق الجيل الثاني (شجم). رصد شجم إشارات عن طريق استخدام ليزر مسح نظام الفحص المجهري مقرونا إثارة الأشعة تحت حمراء خفيفة المصدر هو أسلوب تصوير حديثة مثيرة التي تتمتع بالاستخدام على نطاق واسع في مجال العلوم الطبية الحيوية. وهكذا، أجريت الدراسة الحالية بغية تقييم استخدام الفحص المجهري شجم كوسيلة لقياس الناجمة عن الآثار العابرة للربط في السابقين فيفو الصلبة الأرنب، بعد حقن مادة كيميائية العابرة للربط عامل في الفضاء دون الحفرة تينون (ش)، حقن النهج هي الممارسة المعتادة لتسبب تخدير العين خلال الإجراءات السريرية طب العيون. من هذه المادة الكيميائية العابرة للربط عامل، هيدروكسيميثيلجليسيناتي الصوديوم (SMG)، من فئة من المواد الحافظة مستحضرات التجميل المعروف باسم فورمالدهايد الإفراج عن عملاء (فارس). Scleral التغييرات بعد رد فعل مع إس أم جي أدت إلى زيادات في إشارات SHG ويرتبط بالتغيرات في درجة الحرارة تمسخ الحرارية، أسلوب قياسي لتقييم فعل الأنسجة الآثار العابرة للربط.
Introduction
قصر النظر التدريجي هو افترض أن يكون علاجها عن طريق غير الانزيمية scleral العابرة للربط (الضوئية و/أو الكيميائية)، الأمر الذي يجعل الشعور نظراً إلى أن حجب العابرة الانزيمية للربط الكولاجين يمكن زيادة الحرمان النموذج التجريبي (FD)-التي يسببها 1من قصر النظر. ناقش الشيخ وفيليبس2 مؤخرا بجدوى وإمكانية استخدام القياسية إشعاع الأشعة فوق البنفسجية-أ (UVA)-بوساطة والريبوفلافين الضوئية العابرة للربط (المعروف أيضا ببروتوكول درسدن)، يختصر هنا ك (ريبوفلافين CXL) لتحقيق الاستقرار سكليرال الخلفي لوقف استطالة محورية في قصر النظر. هذا الأسلوب الضوئية قد استخدمت بنجاح لعلاج زعزعة استقرار سطح الكرة الأرضية الأمامية (أي، انتفاخ القرنية) رأيت في المخروطية ووظيفة-اسيك كيراتيكتاسيا. ومع ذلك، تطبيق هذا البروتوكول CXL الصلبة العينية يعوقه قضايا تتصل بالصعوبات في الوصول إلى الصلبة الخلفي مع مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية)، فضلا عن الحاجة إلى تعديل كبير أنسجة سطحية مساحة أكبر. أن يقال، أن النهج CXL قد استخدمت لوقف استطالة محورية في النموذج بصريا يحرم الأرانب (تارسورهافي)، على الرغم من أن مناطق متعددة من الخلفية الصلبة المطلوبة مناطق التشعيع منفصلة متعددة في تلك الدراسة3. على النقيض من ذلك، يمكن أن تمثل حقن عامل استقرار الكيميائية (أي، عامل العابرة للربط) عبر الفضاء ش طريقة أسهل لتعديل الخلفية الصلبة العينية، تجنب الحاجة إلى إدخال مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية. تقنية حقن هذا معروف كوسيلة مفيدة لتحريض التخدير العين خلال إجراءات طب العيون مثل إعتام عدسة العين جراحة4،،من56. وصف Wollensak7 سابقا استخدام حقنه ش باستخدام جليسيرالديهيدي (كيميائية cross-linking عامل مماثلة في مفهوم إلى فورمالدهايد الإفراج عن عملاء (فارس) الموصوفة في هذه الدراسة) تشديد الصلبة الأرانب وجينيبين وقد وقد تبين للحد من طول محوري في فد خنازير غينيا8،9. وقد أثبتت هؤلاء المحققين ميزة واضحة لاستخدام عامل كيميائية القابلة لذوبان عبر تقنية ككسل الضوئية. وهكذا، سكليرال العابرة للربط باستخدام عامل كيميائية القابلة لحقن لبعض الأنواع، بما في ذلك فارس (أي، TXL)10، يمكن أن توفر طريقة علاج ممكنة لوقف التقدم لاستطالة scleral ينظر في قصر النظر.
في البروتوكولات المقدمة هنا، نستخدم حلاً cross-linking كيميائية للصوديوم هيدروكسيميثيلجليسيناتي (SMG)، سلمت عن طريق حقن sT على الصلبة العينية من عيون الأرانب المأخوذة. وقد نفذنا بروتوكولات مماثلة سبق العابرة الكيميائية الموضعية للربط في القرنية. لا سيما في تلك الدراسات المبلغ عنها سابقا، تركيز تعتمد التأثيرات العابرة للربط يمكن الحصول عليها باستخدام SMG، مع مجموعة تأثير تمتد كذلك أعلاه التي يمكن تحقيقها مع CXL الضوئية كما يحددها التحليل الحراري تمسخ11 .
هنا يمكننا وصف بروتوكولات لتقييم تأثير cross-linking SMG تسليمها عن طريق الحقن ش scleral الأنسجة، تمسخ الحرارية باستخدام القياس المسح التفاضلي (DSC)، والفحص المجهري توليد النغمة التوافقية الثانية (شجم).
استخدام القياس المسح التفاضلي (DSC)، يعرف أيضا باسم التحليل الحراري، انتقال تمسخ حرارية يقاس، هو للأنسجة scleral يغلب استرشادا بخصائص كولاجينس فيبريلار، نظراً إلى أنها تشكل أغلبية الجزء الأكبر من البروتين. هذا الأسلوب يقوم بتقييم استقرار هيكل الجزيئية الكولاجين والسندات cross-linked ييفات الكولاجين، هيكل البروتين العالي الرئيسية إلى استقرار. أثناء التسخين في DSC، هو تحقيق درجة حرارة التحول حرجة التي ينتج عنها تمسخ جزيء الكولاجين، أسفر عن uncoiling الحلزون الثلاثي، عملية التي تشكل ما يعرف عادة باسم الجيلاتين. هذا تمسخ الحرارية يعطل السندات الهيدروجين على طول جزيء الكولاجين ويمكن أن تحول إلى درجات حرارة أعلى من خلال المستحث العابرة للربط أساليب12،13. وقد تم استخدام هذا الأسلوب لعقود عديدة، لا سيما في هذه الصناعة الحيوية، والعمليات التي تشمل صناعة الجلود. ومع ذلك، هذا الأسلوب يتطلب استخراج الأنسجة الصلبة ولذلك يمكن إلا تكون مفيدة كأسلوب السابقين فيفو .
الجيل الثاني-التوافقي مجهرية (شجم) يستند إلى الخصائص البصرية غير الخطية لمواد معينة، مع البيئات غير سينتروسيميتريك الجزيئية. في مثل هذه المواد، والضوء المكثف، على سبيل المثال الضوء المنتجة بالليزر، يولد إشارات SHG، الذي تضاعف في ضوء الحادث في التردد. هي المواد البيولوجية التي هي معروفة لإنشاء إشارات SHG الكولاجين، ميكروتوبوليس، والميوسين العضلية. على سبيل المثال، سوف تنبعث منها الكولاجين متحمس مع الأشعة تحت الحمراء من الطول الموجي نانومتر 860 إشارة SHG في النطاق المرئي مع الطول الموجي نانومتر 430. الثانية جيل التوافقي (SHG) إشارة التصوير وسيلة واعدة لتقييم العابرة الكولاجين العلاجية للربط. وقد كان معروفا منذ أكثر من 30 عاماً أن ييفات الكولاجين في أنسجة تنبعث منها إشارات SHG14. ومع ذلك، إلا في الآونة الأخيرة يمكن الصور عالية الدقة الحصول على15 في مجموعة متنوعة من الأنسجة، بما في ذلك وتر16، والجلد، والغضاريف17،18من الأوعية الدموية، والكولاجين الهلام19.
استناداً إلى هذه المعرفة، تقيم هذه الدراسة التغييرات إشارة SHG المستحث في الصلبة العينية عن طريق إس أم جي التي يسببها كيميائيا العابرة للربط من الكولاجين. النتائج تشير إلى أن تعديل SMG الصلبة العينية تزيد الإشارات SHG المنتجة من الأنسجة حزم ألياف الكولاجين (أعلى ترتيب هيكل رباعي يضم ييفات الكولاجين) وأيضا تنتج تغيير السمات هيكلية في الكولاجين شبكة الألياف، تنعكس في الألياف حزمة “استقامة.”
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أظهرت تجارب أجريت الأدلة المؤيدة لاستخدام الفحص المجهري إشارة SHG كأسلوب للتقييم للكولاجين العابرة للربط آثار في الصلبة العينية، زيادة إمكانية استخدام هذه التقنية كأداة رصد للعلاجات العابرة للربط أن استهداف بروتينات الكولاجين. من المذكرة، أداة بالفعل في الاستخدام السريري التي يحتمل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون تونجالب تيزيل، دكتوراه في الطب، للتشاور بشأن حقن ش؛ تيريزا سويني، دكتوراه، للتشاور بشأن الفحص المجهري SHG؛ وجيمي دونغ من التصميم والمورد الحيوي ومرفق بيوستاتيستيكال الأساسية للمعهد ايرفينغ في المركز الطبي بجامعة كولومبيا.
دعم في جزء من البحوث “منع العمى” والمعاهد الوطنية الصحية منح نكر UL1RR024156 نيي P30 EY019007، NCI P30 CA013696 و R01EY020495 نيي (DCP). جامعة كولومبيا يملك الملكية الفكرية ذات الصلة: الولايات المتحدة إصدار براءات الاختراع لا: 8,466,203 ولا: 9,125,856. الدولي البراءات المعلقة: PCT/US2015/020276.
تم جمع الصور في كونفوكال ومنح “المتخصصة مجهرية الموارد المشتركة” من مركز السرطان الشامل ايرفينغ هربرت في جامعة كولومبيا، تدعمها المعاهد الوطنية للصحة #P30 CA013696 (المعهد الوطني للسرطان). المجهر [كنفوكل] تم شراؤها مع المعاهد الوطنية للصحة منح #S10 RR025686.
Materials
| MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V | EMD Millipore, Massachusetts, USA | Double distilled, deionized water. – protocol step 1.1.1 | |
| Sodium hydroxymethylglycinate | Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA | Crosslinking reagent – protocol step 1.1.2 | |
| Injection needle with luer-lock syringe | BD Eclipse, NJ, USA | Syringe for sub tenon injection. – protocol step 2.1 | |
| Rabbit head | La Granja poultry | Outbred | Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. – protocol step 2.2 |
| Tono-pen | Reichter Technologies Depew, NY | IOP measurements – protocol step 2.4 | |
| DSC 6000 Autosampler | Perkin-Elmer Waltham, MA, USA | Thermal denaturation analyzer – protocol step 7.4 | |
| Pyris software | Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA | Ver 11.0 | protocol step 7.5 |
| CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm – protocol step 8.1.1. | |
| GenTeal | Alcon, Fort Worth, TX | B000URVDQ8 | Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation – 8.1.1 |
| Chameleon Vision II | Coherent, Santa Clara,CA, USA | Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. – protocol step 8.1.11 | |
| AttoFluor cell chamber | Thermo Fisher Scientific Inc | A7816 | Fixation of the cover slip – protocol step 8.1.3 |
| 25-mm round coverslips, #1.5 | Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA | GG-25-1.5 | protocol step 8.1.3 |
| Eclipse Ti-E | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | protocol step 8.1.4. | |
| Non-descanned (NDD) GaAsP detector | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Equipped with a 400-450 nm band pass filter – protocol step 8.1.7 | |
| A1R-MP laser scanning system | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. – protocol step 8.1.8 | |
| NIS Elements software | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Ver 4.3 | refered to as "software" in the text – protocol step 8.1.9 |
| Fiji/ImageJ | National Institute of Health | protocol step 9.1.2 | |
| NeuronJ | Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands | https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | Ver 14 | protocol step 9.2.8 |
References
- McBrien, N. A., Norton, T. T. Prevention of collagen crosslinking increases form-deprivation myopia in tree shrew. Exp Eye Res. 59 (4), 475-486 (1994).
- Elsheikh, A., Phillips, J. R. Is scleral cross-linking a feasible treatment for myopia control?. Ophthalmic Physiol Opt. 33 (3), 385-389 (2013).
- Dotan, A., et al. Scleral cross-linking using riboflavin and ultraviolet-a radiation for prevention of progressive myopia in a rabbit model. Exp Eye Res. 127, 190-195 (2014).
- Canavan, K. S., Dark, A., Garrioch, M. A. Sub-Tenon’s administration of local anaesthetic: a review of the technique. Br J Anaesth. 90 (6), 787-793 (2003).
- Guise, P. Sub-Tenon’s anesthesia: an update. Local Reg Anesth. 5, 35-46 (2012).
- Ahn, J. S., et al. A sub-Tenon’s capsule injection of lidocaine induces extraocular muscle akinesia and mydriasis in dogs. Vet J. 196 (1), 103-108 (2013).
- Wollensak, G., Redl, B. Gel electrophoretic analysis of corneal collagen after photodynamic cross-linking treatment. Cornea. 27 (3), 353-356 (2008).
- Liu, T. X., Wang, Z. Collagen crosslinking of porcine sclera using genipin. Acta Ophthalmol. 91 (4), e253-e257 (2013).
- Wang, M., Corpuz, C. C. Effects of scleral cross-linking using genipin on the process of form-deprivation myopia in the guinea pig: a randomized controlled experimental study. BMC Ophthalmol. 15, 89 (2015).
- Babar, N., et al. Cosmetic preservatives as therapeutic corneal and scleral tissue cross-linking agents. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1274-1282 (2015).
- Kim, S. Y., et al. Evaluating the Toxicity/Fixation Balance for Corneal Cross-Linking With Sodium Hydroxymethylglycinate (SMG) and Riboflavin-UVA (CXL) in an Ex Vivo Rabbit Model Using Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Cornea. 35 (4), 550-556 (2016).
- da Cruz, L. G., Moraes, G. D. A., Nogueira, R. F., Morandim-Giannetti, A. D. A., Bersanetti, P. A. DSC characterization of rabbit corneas treated with Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville extracts. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. , (2017).
- Bersanetti, P. A., et al. Characterization of Rabbit Corneas Subjected to Stromal Stiffening by the Acai Extract (Euterpe oleracea). Curr Eye Res. 42 (4), 528-533 (2017).
- Freund, I., Deutsch, M. Second-harmonic microscopy of biological tissue. Opt Lett. 11 (2), 94 (1986).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21 (11), 1356-1360 (2003).
- Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophys J. 88 (2), 1377-1386 (2005).
- Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J Anat. 215 (6), 682-691 (2009).
- Tsamis, A., Krawiec, J. T., Vorp, D. A. Elastin and collagen fibre microstructure of the human aorta in ageing and disease: a review. J R Soc Interface. 10 (83), 20121004 (2013).
- Raub, C. B., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys J. 92 (6), 2212-2222 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Zyablitskaya, M., et al. Evaluation of Therapeutic Tissue Crosslinking (TXL) for Myopia Using Second Harmonic Generation Signal Microscopy in Rabbit Sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (1), 21-29 (2017).
- Steven, P., Muller, M., Koop, N., Rose, C., Huttmann, G. Comparison of Cornea Module and DermaInspect for noninvasive imaging of ocular surface pathologies. J Biomed Opt. 14 (6), 064040 (2009).
- Han, M., Giese, G., Bille, J. F. Second harmonic generation imaging of collagen fibrils in cornea and sclera. Optics Express. 13 (15), 5791-5797 (2005).
- Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).
- Teng, S. W., et al. Multiphoton autofluorescence and second-harmonic generation imaging of the ex vivo porcine eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1216-1224 (2006).
- Rao, R. A., Mehta, M. R., Leithem, S., Toussaint, K. C. Quantitative analysis of forward and backward second-harmonic images of collagen fibers using Fourier transform second-harmonic-generation microscopy. Opt Lett. 34 (24), 3779-3781 (2009).
- Morishige, N., Petroll, W. M., Nishida, T., Kenney, M. C., Jester, J. V. Noninvasive corneal stromal collagen imaging using two-photon-generated second-harmonic signals. J Cataract Refract Surg. 32 (11), 1784-1791 (2006).
- Aptel, F., et al. Multimodal nonlinear imaging of the human cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2459-2465 (2010).
- Winkler, M., et al. Nonlinear optical macroscopic assessment of 3-D corneal collagen organization and axial biomechanics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (12), 8818-8827 (2011).
- Morishige, N., Takagi, Y., Chikama, T., Takahara, A., Nishida, T. Three-dimensional analysis of collagen lamellae in the anterior stroma of the human cornea visualized by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (2), 911-915 (2011).
- Gore, D. M., et al. Two-photon fluorescence microscopy of corneal riboflavin absorption. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (4), 2476-2481 (2014).
- Park, C. Y., Lee, J. K., Chuck, R. S. Second Harmonic Generation Imaging Analysis of Collagen Arrangement in Human Cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (9), 5622-5629 (2015).
- Quantock, A. J., et al. From nano to macro: studying the hierarchical structure of the corneal extracellular matrix. Exp Eye Res. 133, 81-99 (2015).
- Morishige, N., et al. Quantitative analysis of collagen lamellae in the normal and keratoconic human cornea by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (12), 8377-8385 (2014).
- Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (3), 1087-1094 (2007).
- Steven, P., Hovakimyan, M., Guthoff, R. F., Huttmann, G., Stachs, O. Imaging corneal crosslinking by autofluorescence 2-photon microscopy, second harmonic generation, and fluorescence lifetime measurements. J Cataract Refract Surg. 36 (12), 2150-2159 (2010).
- Bueno, J. M., et al. Multiphoton microscopy of ex vivo corneas after collagen cross-linking. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (8), 5325-5331 (2011).
- McQuaid, R., Li, J. J., Cummings, A., Mrochen, M., Vohnsen, B. Second-Harmonic Reflection Imaging of Normal and Accelerated Corneal Crosslinking Using Porcine Corneas and the Role of Intraocular Pressure. Cornea. 33 (2), 125-130 (2014).
- Laggner, M., et al. Correlation Between Multimodal Microscopy, Tissue Morphology, and Enzymatic Resistance in Riboflavin-UVA Cross-Linked Human Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (6), 3584-3592 (2015).
- Chai, D., et al. Quantitative assessment of UVA-riboflavin corneal cross-linking using nonlinear optical microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4231-4238 (2011).
- Scarcelli, G., et al. Brillouin microscopy of collagen crosslinking: noncontact depth-dependent analysis of corneal elastic modulus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (2), 1418-1425 (2013).
- Shao, P., Besner, S., Zhang, J., Scarcelli, G., Yun, S. H. Etalon filters for Brillouin microscopy of highly scattering tissues. Opt Express. 24 (19), 22232-22238 (2016).
- Kumar, C. M., McNeela, B. J. Ultrasonic localization of anaesthetic fluid using sub-Tenon’s cannulae of three different lengths. Eye (Lond). 17 (9), 1003-1007 (2003).
- Winder, S., Walker, S. B., Atta, H. R. Ultrasonic localization of anesthetic fluid in sub-Tenon’s, peribulbar, and retrobulbar techniques. J Cataract Refract Surg. 25 (1), 56-59 (1999).
- Ripart, J., Eledjam, J. J. [Locoregional anesthesia for ophthalmic surgery: unique episcleral injection (sub-tenon) in the internal canthus]. Ann Fr Anesth Reanim. 17 (4), Fi72-Fi74 (1998).
- Meek, K. M., Hayes, S. Corneal cross-linking–a review. Ophthalmic Physiol Opt. 33 (2), 78-93 (2013).
- Wollensak, G., Spoerl, E. Collagen crosslinking of human and porcine sclera. J Cataract Refract Surg. 30 (3), 689-695 (2004).
- Paik, D. C., Wen, Q., Airiani, S., Braunstein, R. E., Trokel, S. L. Aliphatic beta-nitro alcohols for non-enzymatic collagen cross-linking of scleral tissue. Exp Eye Res. 87 (3), 279-285 (2008).
