दूसरे चिकित्सीय ऊतक के मूल्यांकन के लिए एक उपकरण के रूप में खरगोश श्वेतपटल में दूसरी सुरीले पीढ़ी संकेतों को पार से जोड़ने (TXL) निकट दृष्टि के लिए
Summary
इस प्रोटोकॉल रासायनिक पार के मूल्यांकन के लिए तकनीक का वर्णन खरगोश श्वेतपटल के दूसरे सुरीले पीढ़ी इमेजिंग और अंतर स्कैनिंग calorimetryका उपयोग कर जोड़ने ।
Abstract
तरीके रासायनिक बांड शुरू करने से ऊतक को मजबूत बनाने के लिए (गैर एंजाइमी पार से जोड़ने) संरचनात्मक प्रोटीन में (fibrillar कोलेजन) चिकित्सा के लिए photochemical पार जोड़ने और ऊतक पार से जोड़ने (TXL) तरीके शामिल हैं. यांत्रिक ऊतक संपत्ति परिवर्तन उत्प्रेरण के लिए इस तरह के तरीके corneal thinning में कॉर्निया के लिए नियोजित किया जा रहा है (यांत्रिक रूप से कमजोर) विकारों जैसे keratoconus के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रगतिशील निकट दृष्टि में श्वेतपटल, जहां thinning और पीछे के कमजोर श्वेतपटल होती है और संभावना के सलए बढ़ाव का योगदान होता है । इस तरह के ऊतकों को मजबूत बनाने के लिए प्राथमिक लक्ष्य प्रोटीन fibrillar कोलेजन जो कॉर्निया और श्वेतपटल में शुष्क वजन प्रोटीन के महान बहुमत का गठन कर रहे हैं । अनायास, fibrillar कोलेजन ऊतक extracellular अंतरिक्ष में दूसरी सुरीले पीढ़ी के संकेत का मुख्य स्रोत हैं । इसलिए, ऐसे पार के माध्यम से प्रेरित उन के रूप में कोलेजन प्रोटीन के संशोधन, चिकित्सा को जोड़ने, संभवतः पता लगाया जा सकता है और दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी माइक्रोस्कोपी (SHGM) के उपयोग के माध्यम से quantitated. एक लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी एक अवरक्त उत्तेजना प्रकाश स्रोत के साथ युग्मित प्रणाली के उपयोग के माध्यम से SHGM संकेतों की निगरानी एक रोमांचक आधुनिक इमेजिंग तरीका है कि जैव चिकित्सा विज्ञान में व्यापक उपयोग का आनंद ले रहा है । इस प्रकार, वर्तमान अध्ययन के लिए एक साधन के रूप में SHGM माइक्रोस्कोपी के उपयोग का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता था के रूप में प्रेरित पार-प्रभाव को मापने के लिए पूर्व vivo खरगोश श्वेतपटल में, एक इंजेक्शन के बाद एक रासायनिक पार जोड़ने एजेंट उप में-Tenon के अंतरिक्ष (sT), एक इंजेक्शन दृष्टिकोण है कि आंखों नैदानिक प्रक्रियाओं के दौरान नेत्र संज्ञाहरण के कारण के लिए मानक अभ्यास है । रासायनिक पार से जोड़ने एजेंट, सोडियम hydroxymethylglycinate (47), कॉस्मेटिक विरक्षकों formaldehyde रिहा एजेंटों (फारों) के रूप में जाना जाता है के एक वर्ग से है । Scleral परिवर्तन के साथ की प्रतिक्रिया के बाद 47 स्वसहायता समूहों के संकेतों में वृद्धि हुई है और थर्मल विकार तापमान, प्रेरित ऊतक पार से जोड़ने के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक मानक विधि में बदलाव के साथ संबद्ध ।
Introduction
प्रगतिशील अदूरदर्शिता गैर के माध्यम से इलाज किया जा माने है एंजाइमी scleral पार से जोड़ने (photochemical और/या रासायनिक), जो कि अवरुद्ध कोलेजन एंजाइमी पार जोड़ने प्रयोगात्मक फार्म वंचित (एफडी)-प्रेरित बढ़ा सकते है समझ में आता है अदूरदर्शिता1. Elsheikh और फिलिप्स2 हाल ही में व्यवहार्यता और मानक पराबैंगनी का उपयोग करने की क्षमता पर चर्चा की-एक विकिरण (UVA)-riboflavin photochemical पार-जोड़ने मध्यस्थता (भी ड्रेसडेन प्रोटोकॉल के रूप में जाना), यहां संक्षिप्त के रूप में (riboflavin CXL) पीछे scleral स्थिरीकरण के लिए निकट दृष्टि में अक्षीय बढ़ाव को रोकने के लिए । इस photochemical विधि सफलतापूर्वक पूर्वकाल ग्लोब सतह (यानी, उभार कॉर्निया) के स्थिरीकरण के इलाज के लिए इस्तेमाल किया गया है keratoconus और बाद में देखा LASIK keratectasia । हालांकि, श्वेतपटल के लिए इस CXL प्रोटोकॉल के आवेदन एक पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश स्रोत के साथ पीछे श्वेतपटल तक पहुंचने में कठिनाइयों से संबंधित मुद्दों से रुकावट है, साथ ही साथ एक बहुत अधिक ऊतक सतह क्षेत्र को संशोधित करने की जरूरत है । यह कहा जा रहा है, CXL दृष्टिकोण नेत्रहीन फार्म से वंचित खरगोशों में अक्षीय बढ़ाव को रोकने के लिए इस्तेमाल किया गया है (tarsorrhaphy द्वारा), हालांकि पीछे श्वेतपटल के कई क्षेत्रों में है कि अध्ययन में कई अलग विकिरण क्षेत्रों की आवश्यकता3। इसके विपरीत, एक रासायनिक स्थिर एजेंट के इंजेक्शन (यानी, पार से एजेंट को जोड़ने) sT अंतरिक्ष के माध्यम से एक आसान तरीका पीछे श्वेतपटल संशोधित प्रतिनिधित्व कर सकता है, एक यूवी प्रकाश स्रोत शुरू करने के लिए की जरूरत से परहेज । यह इंजेक्शन तकनीक अच्छी तरह से मोतियाबिंद सर्जरी4,5,6के रूप में आंखों प्रक्रियाओं के दौरान नेत्र संज्ञाहरण उत्प्रेरण का एक उपयोगी तरीका के रूप में जाना जाता है । Wollensak7 पहले एक sT इंजेक्शन का उपयोग glyceraldehyde का उपयोग वर्णित है (एक रासायनिक पार-अवधारणा में इसी तरह के एजेंट formaldehyde जारी एजेंटों (फारों) को जोड़ने के लिए इस अध्ययन में वर्णित) ठोस खरगोश श्वेतपटल और genipin है एफडी गिनी सूअरों8,9में अक्षीय लंबाई सीमा दिखाया गया है । इन जांचकर्ताओं photochemical CXL तकनीक पर एक घुलनशील रासायनिक एजेंट का उपयोग करने का एक स्पष्ट लाभ का प्रदर्शन किया है । इस प्रकार, scleral पार-फारों (यानी, TXL)10सहित कुछ प्रकार के एक इंजेक्शन रासायनिक एजेंट का उपयोग कर जोड़ने, एक व्यवहार्य उपचार विधि के निकट दृष्टि में देखा scleral बढ़ाव की प्रगति को रोकने के लिए प्रदान कर सकता है ।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, हम एक रासायनिक पार सोडियम hydroxymethylglycinate (47) के समाधान को जोड़ने, cadaveric खरगोश आंखों के श्वेतपटल के लिए सेंट इंजेक्शन के माध्यम से दिया का उपयोग करें । हम इसी प्रकार के प्रोटोकॉल लागू किया है पहले सामयिक रासायनिक पार-कॉर्निया में जोड़ने के लिए । विशेष रूप से उन में पहले की रिपोर्ट अध्ययन, एकाग्रता पर निर्भर पार प्रभाव जोड़ने का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है, एक प्रभाव है कि photochemical CXL के साथ अच्छी तरह से ऊपर फैले के रूप में थर्मल विकार विश्लेषण द्वारा निर्धारित की सीमा के साथ.11 .
यहां हम प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए पार-scleral ऊतक, थर्मल विकार स्कैनिंग Calorimetry (डीएससी), और दूसरी सुरीले पीढ़ी माइक्रोस्कोपी (SHGM) का उपयोग कर के लिए सेंट इंजेक्शन के माध्यम से दिया 47 के प्रभाव को जोड़ने का आकलन ।
अवकलन स्कैनिंग calorimetry (DSC), थर्मल विश्लेषण के रूप में भी जाना जाता है का उपयोग करना, एक थर्मल विकार संक्रमण मापा जाता है, जो scleral ऊतक के लिए fibrillar कोलेजन के गुणों द्वारा निर्देशित predominately है, क्योंकि वे थोक बहुमत का गठन प्रोटीन की । इस विधि कोलेजन आणविक संरचना की स्थिरता और पार से जुड़े बांड है कि कोलेजन तंतुओं, प्रधान तृतीयक प्रोटीन संरचना स्थिर मूल्यांकन करता है । DSC में हीटिंग के दौरान, एक महत्वपूर्ण संक्रमण तापमान प्राप्त होता है कि कोलेजन अणु के विकार में परिणाम, ट्रिपल कुंडलित के uncoiling में जिसके परिणामस्वरूप, एक प्रक्रिया है कि रूपों क्या सामांयतः जिलेटिन के रूप में जाना जाता है । इस थर्मल विकार कोलेजन अणु के साथ हाइड्रोजन बांड बाधित और प्रेरित पार के माध्यम से उच्च तापमान को स्थानांतरित कर सकते है12,13तरीकों को जोड़ने । इस विधि में कई दशकों के लिए इस्तेमाल किया गया है, विशेष रूप से और भौतिक उद्योग में प्रक्रियाओं है कि चमड़े बनाने शामिल हैं । हालांकि, इस विधि श्वेतपटल ऊतक निष्कर्षण की आवश्यकता है और इसलिए केवल एक पूर्व vivo तकनीक के रूप में उपयोगी हो सकता है ।
दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी माइक्रोस्कोपी (SHGM) गैर-centrosymmetric आणविक वातावरण के साथ, विशेष सामग्री के गैर रेखीय ऑप्टिकल गुण पर आधारित है. ऐसी सामग्रियों में तीव्र प्रकाश, उदाहरण के लिए लेजर द्वारा उत्पादित प्रकाश, स्वसहायता संकेतों, जिसमें घटना प्रकाश आवृत्ति में दोगुनी हो जाती है उत्पंन करता है । जैविक सामग्री है कि स्वसहायता समूहों के संकेत बनाने के लिए जाना जाता है कोलेजन, microtubules, और मांसपेशी मायोसिन हैं । उदाहरण के लिए, कोलेजन ८६० एनएम तरंग दैर्ध्य की एक अवरक्त प्रकाश के साथ उत्तेजित ४३० एनएम तरंग दैर्ध्य के साथ दिखाई रेंज में एक स्वसहायता समूहों संकेत फेंकना होगा । दूसरी सुरीले उत्पादन (स्वसहायता) सिग्नल इमेजिंग चिकित्सकीय कोलेजन पार से जोड़ने के मूल्यांकन के लिए एक आशाजनक तरीका है । यह 30 से अधिक वर्षों के लिए जाना जाता रहा है कि ऊतकों में कोलेजन तंतुओं का उत्सर्जन स्वसहायता समूहों14संकेत । हालांकि, केवल हाल ही में उच्च संकल्प छवियों के ऊतकों की एक किस्म में15 प्राप्त किया जा सकता है, पट्टा16, त्वचा, उपास्थि17, रक्त वाहिकाओं18, और कोलेजन जैल19में शामिल हैं ।
इस ज्ञान के आधार पर, इस अध्ययन के स्वसहायता समूहों संकेत के माध्यम से श्वेतपटल में प्रेरित परिवर्तन का मूल्यांकन करता है । परिणाम से संकेत मिलता है कि श्वेतपटल के 47 के संशोधन स्वसहायता समूहों ऊतक कोलेजन फाइबर बंडलों से उत्पादित संकेतों को बढ़ाता है (उच्च क्रम चतुर्धातुक कोलेजन तंतुओं के शामिल संरचना) और भी कोलेजन में एक संरचनात्मक सुघड़ परिवर्तन का उत्पादन फाइबर नेटवर्क, फाइबर बंडल में परिलक्षित “सीधे.”
Protocol
Representative Results
Discussion
आयोजित प्रयोगों सबूत स्वसहायता के मूल्यांकन के लिए एक विधि के रूप में संकेत माइक्रोस्कोपी के उपयोग का समर्थन करते हुए दिखाया गया है श्वेतपटल में प्रभाव को जोड़ने, पार के लिए एक निगरानी उपकरण के रूप मे?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक Tongalp Tezel, एमडी, सेंट इंजेक्शन के बारे में परामर्श के लिए धंयवाद; Theresa Swayne, पीएचडी, स्वसहायता समूहों माइक्रोस्कोपी के बारे में परामर्श के लिए; और जिमी दुओंग से डिजाइन और जैव सांख्यिकी संसाधन और कोलंबिया विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर में Irving संस्थान के जैव सांख्यिकीय कोर सुविधा ।
अंधापन को रोकने के लिए अनुसंधान द्वारा भाग में समर्थित और स्वास्थ्य अनुदान के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा NCRR UL1RR024156, नेि P30 EY019007, NCI P30 CA013696, और नेि R01EY020495 (डीसीपी) । कोलंबिया विश्वविद्यालय से संबंधित बौद्धिक संपदा के मालिक: अमेरिका पेटेंट जारी नहीं: ८,४६६,२०३ और नहीं: ९,१२५,८५६ । अंतरराष्ट्रीय पेटेंट लंबित: पीसीटी/US2015/020276.
चित्र हर्बर्ट Irving व्यापक कोलंबिया विश्वविद्यालय में कैंसर केंद्र, NIH अनुदान #P30 CA013696 (राष्ट्रीय कैंसर संस्थान) द्वारा समर्थित के फोकल और विशेष माइक्रोस्कोपी साझा संसाधन में एकत्र किए गए । इस फोकल माइक्रोस्कोप को NIH ग्रांट #S10 RR025686 के साथ खरीदा गया था ।
Materials
| MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V | EMD Millipore, Massachusetts, USA | Double distilled, deionized water. – protocol step 1.1.1 | |
| Sodium hydroxymethylglycinate | Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA | Crosslinking reagent – protocol step 1.1.2 | |
| Injection needle with luer-lock syringe | BD Eclipse, NJ, USA | Syringe for sub tenon injection. – protocol step 2.1 | |
| Rabbit head | La Granja poultry | Outbred | Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. – protocol step 2.2 |
| Tono-pen | Reichter Technologies Depew, NY | IOP measurements – protocol step 2.4 | |
| DSC 6000 Autosampler | Perkin-Elmer Waltham, MA, USA | Thermal denaturation analyzer – protocol step 7.4 | |
| Pyris software | Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA | Ver 11.0 | protocol step 7.5 |
| CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm – protocol step 8.1.1. | |
| GenTeal | Alcon, Fort Worth, TX | B000URVDQ8 | Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation – 8.1.1 |
| Chameleon Vision II | Coherent, Santa Clara,CA, USA | Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. – protocol step 8.1.11 | |
| AttoFluor cell chamber | Thermo Fisher Scientific Inc | A7816 | Fixation of the cover slip – protocol step 8.1.3 |
| 25-mm round coverslips, #1.5 | Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA | GG-25-1.5 | protocol step 8.1.3 |
| Eclipse Ti-E | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | protocol step 8.1.4. | |
| Non-descanned (NDD) GaAsP detector | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Equipped with a 400-450 nm band pass filter – protocol step 8.1.7 | |
| A1R-MP laser scanning system | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. – protocol step 8.1.8 | |
| NIS Elements software | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Ver 4.3 | refered to as "software" in the text – protocol step 8.1.9 |
| Fiji/ImageJ | National Institute of Health | protocol step 9.1.2 | |
| NeuronJ | Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands | https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | Ver 14 | protocol step 9.2.8 |
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