치료 조직 (TXL) 근 시에 대 한 교차 연결의 평가 위한 도구로 토끼 Sclera에 제 2 고조파 발생 신호

Summary

이 프로토콜의 둘째로 고조파 생성 이미징 및 차동 주사를 사용 하 여 토끼 sclera cross-linking 화학 평가 기법을 설명 합니다.

Abstract

치료에 대 한 구조 단백질 (원 collagens)로 화학 채권 (비 효소 cross-linking)을 도입 하 여 조직을 강화 하는 방법 등 광화학 cross-linking 조직 cross-linking (TXL) 방법. 유도 하는 기계적 조직 속성 변경에 대 한 이러한 메서드는 고용 되 고 각 막에 원추 각 막으로 진보적인 근 시에서 sclera (기계적으로 약화) 각 막 숱이 장애에 숱이 고 뒷부분의 약화 공 막과 가능성이 축 신장에 기여 한다. 이러한 조직 강화에 대 한 기본 대상 단백질은 원 collagens 각 막과 공 막에 건조 중량 단백질의 대다수를 구성 하는. 우연히, 원 collagens 조직 세포 외 공간에서 제 2 고조파 발생 신호의 주요 원천입니다. 따라서, 콜라겐 단백질 요법, cross-linking를 통해 유도 등의 수정 수 잠재적으로 감지 되며 두 번째 고조파 세대 현미경 (SHGM) 통해 quantitated. 레이저 적외선 여기 가벼운 현미경 시스템을 스캔을 사용 하 여 신호 모니터링 SHGM 소스는 즐기고 생명 과학 분야에서 광범위 하 게 사용 하는 흥미로운 현대 이미징 방법입니다. 따라서, 현재 연구 에이전트 하위-장부의 공간 (sT), cross-linking 화학 물질의 주입에 따라 토끼 sclera, ex vivo에서 에서 가교 효과 유도 하는 측정 하는 수단으로 SHGM 현미경 검사 법의 사용을 평가 하기 위하여 착수 했다는 사출 접근 즉 안구 마 취 안과 임상 절차 동안에 원인에 대 한 표준 연습. 에이전트 cross-linking 화학 나트륨 hydroxymethylglycinate (서울시), 에이전트 (FARs)를 방출 하는 포름알데히드로 알려진 화장품 방부 제의 클래스입니다. SMG와 반응에 따라 scleral 변경 SHG 신호 증가 귀착되 고 열 변성 온도에 변화를 서로 평가 하는 표준 방법을 유도 효과 cross-linking 조직.

Introduction

으로 콜라겐 효소 cross-linking 차단 실험 양식 부족 (FD)을 증가 시킬 수 있습니다 (광화학 또는 화학), 비 효소 scleral cross-linking를 통해 치료할 수에 진보적인 근 시 가정은-유도 근¹. Elsheikh 및 필립스² 최근 타당성과 표준 A 자외선 방사선 (UVA)를 사용 하 여의 가능성 논의-리 보 플 라빈 광화학 cross-linking (드레스덴 프로토콜 라고도 함), 약식 중재 (리 보 플 라빈 CXL) 여기 근 시 축 신장 중단 후부 scleral 안정화. 이 광화학 방법 keratoconus와 포스트 LASIK keratectasia에서 본 앞쪽 글로브 표면 (즉, 불 룩 한 각 막)의 불안을 치료에 성공적으로 사용 되었습니다. 그러나,의 공 막이 CXL 프로토콜 응용 프로그램 액세스는 자외선 (UV) 광원, 뿐만 아니라 훨씬 더 조직 표면 영역을 수정 하려면 필요 후부 sclera에 어려움에 관련 된 문제에 의해 방해 된다. 비록 후부 sclera의 여러 지역 여러 별도 방사선 조사 영역 그 연구³에 필요한 토끼 (tarsorrhaphy)에 의해 박탈 그 말했다 되는, CXL 접근 사용 되었습니다 시각적 형태로 축 신장 중단 하. 대조적으로, 화학 안정화 에이전트의 (즉, cross-linking 대리인) 세인트 공간을 통해 주입 UV 광원 도입에 대 한 필요성을 피하고 후부 sclera를 수정 하는 간단한 방법을 대표할 수 있었다. 이 주입 기술은 백 내장 수술^4,,56등 안과 절차 동안 안구 마 취를 유도 하는 유용한 방법으로 유명 하다. Wollensak⁷ glyceraldehyde (화학 가교 에이전트 에이전트 (FARs)이이 연구에서 설명 공개 포름알데히드 비슷한 개념)를 사용 하 여 성 주사를 사용 하 여 위에서 설명한는 토끼 sclera 및 genipin 완고 하는 FD 기니 피그^8,9축 길이 제한 하는 것을 보였다. 이 광화학 CXL 기술을 통해 수용 성 화학 약품을 사용 하 여의 명확한 이점을 설명 했다. 따라서, scleral cross-linking FARs (즉, 광장)를 포함 하 여 어떤 종류의 주 사용 화학 약품을 사용 하 여¹⁰, scleral 신장에서 근 시의 진행을 중단 하는 가능한 치료 방법을 제공할 수 있다.

여기에 제시 된 프로토콜, 싱가포르로 토끼 눈의 공 막 엔 세인트 주입을 통해 전달의 나트륨 hydroxymethylglycinate (서울시), 화학 가교 솔루션 사용 하 여. 우리는 각 막에 국 소 화학 cross-linking 이전 유사한 프로토콜을 실행 했다. 그 이전에 보고 된 연구에 특히 집중 효과 cross-linking 종속 얻어질 수 효과 범위를 넘어서는 열 변성 분석^{11 정한 광화학 CXL와 달성 스패닝 SMG를 사용 하 여} .

여기는 성 주사 scleral 조직, 차동 스캐닝 열 량 측정 (DSC), 그리고 두 번째 고조파 세대 현미경 검사 법 (SHGM)를 사용 하 여 열 변성을 통해 전달 하는 SMG의 가교 효과 평가 하기 위해 프로토콜에 설명 합니다.

차동 스캐닝 열 량 측정 (DSC), 라고도 열 분석를 사용 하 여 열 변성 변화 측정, scleral 조직에는 주로 그들은 대량 대다수 구성 이후 원 collagens의 속성에 의해 유도 단백질. 이 메서드는 콜라겐 분자 구조의 안정성과 교원 질 소 주 3 차 단백질 구조 안정화 복사해올된 채권 평가 합니다. DSC에 난방, 동안 중요 한 전환 온도 트리플 헬릭스, 젤라틴으로 알려져 일반적으로 형성 하는 과정의 풀기 결과 콜라겐 분자의 변성 결과 얻을 수 있다. 이 열 변성 콜라겐 분자를 따라 수소 결합을 방해 하 고 유도 가교 방법^12,13더 높은 온도에 이동 될 수 있다. 이 방법은 특히 바이오 산업에에서 많은 십 년간 동안 그리고 가죽 만들기를 포함 하는 프로세스에 대 한 사용 되었습니다. 그러나,이 메서드 sclera 조직 추출 필요 하며 따라서만 수 비보 전 기법으로.

2 차 고조파 생성 현미경 (SHGM) 비 centrosymmetric 분자 환경 특정 재료의 비선형 광학 특성을 기반으로 합니다. 같은 자료, 강렬한 빛에에서 예 빛 레이저에 의해 생성 하, SHG 신호, 사건 빛 주파수에서 두 배가 됩니다 생성 합니다. SHG 신호를 만드는 것으로 알려진 생물학 물자는 콜라겐, microtubules, 및 근육 myosin. 예를 들어 콜라겐 860 nm 파장의 적외선으로 흥분된 430 nm 파장을 가진 보이는 범위에서 SHG 신호를 방출 합니다. 둘째로 고조파 생성 (SHG) 신호 영상 치료 콜라겐 cross-linking 평가 하는 유망한 방법 이다. 그것은 30 년 이상에 대 한 조직에 콜라겐 소 SHG 신호¹⁴방출 알려져 있다. 그러나, 최근에 수 고해상도 이미지 얻을 수¹⁵ 콜라겐 젤¹⁹와 조직, 힘 줄¹⁶, 피부, 연골¹⁷,¹⁸, 혈관 등의 다양 한에서.

이 지식을 바탕으로,이 연구 서울시 화학적으로 유도 된 콜라겐의 cross-linking 통해 sclera에 유도 SHG 신호 변화를 평가 합니다. 결과 표시는 공 막의 SMG 수정 SHG 신호 조직 콜라겐 섬유 번들 (높은 순서 제 사기 구조 교원 질 소의 구성)에서 생산을 증가 하 고 또한 콜라겐에 구조적인 형태 론 적 변화를 생산 하 고 섬유 네트워크, 섬유 번들 “교정.”에 반영

Protocol

모든 절차는 그대로 outbred 토끼 머리에서 싱가포르로 토끼 눈을 사용 하 여 수행 되었다. 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 모든 기관 및 국가 지침 따라 했다. 1입니다. 솔루션의 준비 서울시 의회에 대 한 준비: 나트륨 중 탄산염 솔루션 (NaHCO3) 솔루션 NaHCO3 파우더는 증류수의 1 mL에 용 해의 0.0165 g를 사용 하 여 0.2 M 농도의 1 mL를 준비 합니다. 800 m…

Representative Results

광장 cross-linking 효과 평가 하는 시험 방법으로 열 변성 온도 (Tm): 토끼 눈의 16 쌍의 총 의회 절차에 대 한이 실험에서 사용 되었다. 이 연구의 초기 부분으로 싱가포르로 토끼 머리에 세인트 공간 통해 SMG 상호 에이전트의 단일 주사에 의해 유도 된 가교 효과의 지역화 평가 했다. 실험의이 유형은 하나 이상의 위치에 주사 sclera의 원하는 영역을 안정화 하는 데 …

Discussion

실시 실험 콜라겐 cross-linking sclera, cross-linking 치료에 대 한 모니터링 도구로이 기법을 사용 하 여 미래의 가능성 제기에 효과의 평가 위한 방법으로 SHG 신호 현미경의 사용을 지 원하는 증거를 나타났습니다. 그는 콜라겐 단백질을 대상. 메모의 악기는 이미 잠재적으로이 SHG 신호를 캡처할 수 있는 임상 사용 중에서입니다. 이 악기는 주로 이미징 피부 인간의 피에 대 한 설계, 이미지 각 막과 공 막…

Materials

MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V	EMD Millipore, Massachusetts, USA		Double distilled, deionized water. – protocol step 1.1.1
Sodium hydroxymethylglycinate	Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA		Crosslinking reagent – protocol step 1.1.2
Injection needle with luer-lock syringe	BD Eclipse, NJ, USA		Syringe for sub tenon injection. – protocol step 2.1
Rabbit head	La Granja poultry	Outbred	Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. – protocol step 2.2
Tono-pen	Reichter Technologies Depew, NY		IOP measurements – protocol step 2.4
DSC 6000 Autosampler	Perkin-Elmer Waltham, MA, USA		Thermal denaturation analyzer – protocol step 7.4
Pyris software	Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA	Ver 11.0	protocol step 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm – protocol step 8.1.1.
GenTeal	Alcon, Fort Worth, TX	B000URVDQ8	Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation – 8.1.1
Chameleon Vision II	Coherent, Santa Clara,CA, USA		Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. – protocol step 8.1.11
AttoFluor cell chamber	Thermo Fisher Scientific Inc	A7816	Fixation of the cover slip – protocol step 8.1.3
25-mm round coverslips, #1.5	Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA	GG-25-1.5	protocol step 8.1.3
Eclipse Ti-E	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		protocol step 8.1.4.
Non-descanned (NDD) GaAsP detector	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		Equipped with a 400-450 nm band pass filter – protocol step 8.1.7
A1R-MP laser scanning system	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. – protocol step 8.1.8
NIS Elements software	Nikon Instruments, Melville, NY, USA	Ver 4.3	refered to as "software" in the text – protocol step 8.1.9
Fiji/ImageJ	National Institute of Health		protocol step 9.1.2
NeuronJ	Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands		https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2
Microsoft Excel	Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA	Ver 14	protocol step 9.2.8