Andre harmonisk generasjon signaler i kanin Sclera som et verktøy for evaluering av terapeutiske vev Cross-linking (TXL) for nærsynthet

Summary

Denne protokollen beskriver teknikker for å vurdere kjemiske cross-linking av kanin sclera bruker andre harmonisk generasjon bildebehandling og differensial skanning calorimetry.

Abstract

Metoder for å styrke vev ved å innføre kjemisk obligasjoner (ikke-enzymatisk cross-linking) i strukturelle proteiner (fibrillar collagens) for terapi inkluderer fotokjemisk cross-linking og vev cross-linking (TXL) metoder. Slike metoder for å indusere mekanisk vev endringer er blir ansatt å hornhinnen i hornhinnen tynning (mekanisk svekket) lidelser som keratokonus samt sclera i progressiv myopi, tynt og svekkelsen av bakre sclera oppstår og trolig bidrar til aksial forlengelse. De primære målet proteinene for slike vev styrke er fibrillar collagens som utgjør majoriteten av tørrvekt proteiner i hornhinnen og sclera. Tilfeldig, er fibrillar collagens den viktigste kilden til andre harmonisk generasjon signaler i vev ekstracellulære plass. Derfor kan modifikasjoner av kollagen proteiner, slik som indusert gjennom cross-linking terapier, potensielt oppdages og quantitated ved hjelp av andre harmonisk generasjon mikroskopi (SHGM). Overvåking SHGM signaler ved hjelp av en laser skanning mikroskopi systemet kombinert med excitation infrarødt lys er en spennende moderne bildebehandling metode som nyter utstrakt bruk i biomedisinsk vitenskapene. Derfor studien ble gjennomført for å vurdere bruken av SHGM mikroskopi som et middel til å måle indusert cross-linking effekter i ex vivo kanin sclera, etter injeksjon av en kjemisk cross-linking agent i sub-Tenon plass (sT), en injeksjon tilnærming som er vanlig praksis for forårsaker okulær anestesi under ophthalmologic kliniske prosedyrer. Kjemisk cross-linking agent, er natrium hydroxymethylglycinate (SMG), en klasse av kosmetiske konserveringsmidler kjent som formaldehyd slippe agenter (FARs). Innbukking endringer etter reaksjon med SMG resulterte i en økning i SHG signaler og korrelert med endringer i termisk rødsprit temperatur, en standardmetode for å vurdere indusert vev cross-linking effekter.

Introduction

Progressiv myopi er postulert skal behandles gjennom ikke-enzymatisk Innbukking cross-linking (fotokjemisk og/eller kjemisk), som er fornuftig gitt at blokkerer kollagen enzymatisk cross-linking kan øke eksperimentelle skjemaet deprivasjon (FD)-indusert nærsynthet¹. Elsheikh og Phillips² nylig diskutert gjennomførbarhet og potensialet for å bruke standard UV-A bestråling (UVA)-riboflavin mediert fotokjemisk cross-linking (også kjent som Dresden protocol), forkortet som (riboflavin CXL) for bakre Innbukking stabilisering å stanse aksial forlengelse i myopi. Denne fotokjemisk metoden har blitt brukt til behandling av destabilisering av fremre verden overflaten (dvs., svulmende hornhinnen) sett i keratoconus og stolpe-LASIK keratectasia. Men hindret anvendelsen av denne CXL protokollen for sclera av spørsmål knyttet til vanskeligheter med tilgang til bakre sclera med en ultrafiolett (UV) lys kilde, samt behovet for å endre en mye større vev areal. Som blir sagt, CXL tilnærmingen er brukt til å stoppe aksial forlengelse i visuelt skjemaet fratatt kanin (av tarsorrhaphy), selv om flere områder av bakre sclera kreves flere separate bestråling soner i at studien³. Derimot kan injeksjon av en stabiliserende kjemiske middel (dvs., cross-linking agent) via sT plassen representere en enklere måte endre bakre sclera, unngå behovet for å innføre en UV lyskilde. Denne injeksjon teknikken er kjent som en nyttig måte å indusere okulær anestesi under ophthalmologic prosedyrer som cataract kirurgi^4,5,6. Wollensak⁷ har beskrevet tidligere bruk av sT injeksjon med glyceraldehyde (en kjemisk cross-linking agent lignende i konsept til formaldehyd slippe agenter (FARs) beskrevet i denne studien) til stive kanin sclera og genipin vist seg å begrense aksial lengde i FD marsvin^8,9. Disse etterforskere har vist en klar fordel av benytter en løselig kjemiske middel over fotokjemisk CXL teknikken. Dermed Innbukking cross-linking bruker en injiserbare kjemiske middel av noen type, inkludert FARs (dvs., TXL)¹⁰, kan gi en mulig behandlingsmetode å stoppe utviklingen av Innbukking forlengelse sett i myopi.

I protokollene som presenteres her, bruker vi en kjemisk cross-linking løsning av natrium hydroxymethylglycinate (SMG), levert via sT injeksjon til sclera cadaveric kanin øyne. Vi har implementert lignende protokollene tidligere for aktuell kjemiske cross-linking i hornhinnen. Spesielt i de tidligere rapportert studiene, kan konsentrasjon avhengige cross-linking effekter oppnås ved hjelp av SMG, med en effekt rekkevidde som spenner over som oppnåelig med fotokjemisk CXL som termisk rødsprit analyse¹¹ .

Her beskriver vi for å vurdere cross-linking effekten av SMG levert via sT injeksjoner til Innbukking vev, termisk rødsprit differensial skanning Calorimetry (DSC) og andre harmonisk generasjon mikroskopi (SHGM).

Ved hjelp av differensial skanning calorimetry (DSC), også kjent som termisk analyse, er en termisk rødsprit overgang målt, som for Innbukking vev er hovedsakelig guidet av egenskapene til de fibrillar collagens, siden de utgjør flertallet bulk protein. Denne metoden evaluerer stabiliteten av kollagen molekylær struktur og krysskoblet obligasjoner som stabiliserer kollagen fibrils, den fremste tertiære protein-strukturen. Under oppvarming i DSC, er en kritisk overgang temperatur oppnådd som resulterer i denaturering av kollagen molekylet, noe som resulterer i uncoiling av trippel helix, en prosess som det er kjent som gelatin. Dette termiske rødsprit forstyrrer hydrogenbindinger langs kollagen molekylet og kan bli forskjøvet til høyere temperaturer gjennom indusert cross-linking metoder^12,13. Denne metoden er brukt i mange tiår, spesielt i industrien for biologisk materiale og prosesser som inkluderer skinn-making. Men denne metoden krever utvinning av sclera vev og derfor kan bare være nyttig som en ex vivo teknikk.

Andre-harmoniske generasjon mikroskopi (SHGM) er basert på den ikke-lineære optiske egenskapene av bestemt materiale, med ikke-centrosymmetric molekylær miljøer. Slike materialene intens lys, for eksempel lys produsert av lasere, genererer SHG signaler, der det innfallende lyset er doblet i frekvens. Biologisk materiale som kan opprette SHG signaler er kollagen, piskehale som henger og muskel myosin. For eksempel vil kollagen spent med et infrarødt lys av 860 nm bølgelengde avgi en SHG signalet i det synlige området med 430 nm bølgelengde. Andre harmonisk generasjon (SHG) signal imaging er en lovende metode for å vurdere terapeutiske kollagen cross-linking. Det har vært kjent i over 30 år at kollagen fibrils vev avgir SHG signaler¹⁴. Men kan bare nylig Høyoppløslige bilder hentes¹⁵ ulike vev, inkludert sene¹⁶, hud, brusk¹⁷, blodkar¹⁸, og kollagen gels¹⁹.

Basert på denne kunnskapen, evaluerer denne studien SHG signal endringene indusert i sklera gjennom SMG kjemisk indusert cross-linking av kollagen. Resultatene tyder på at SMG endring av sclera øker SHG signalene produsert fra vev kollagen fiber bunter (høyere orden kvartær strukturen består av kollagen fibrils) og produserer også en strukturell morfologiske endring i kollagen nettverk, gjenspeiles i fiber bunt “rette.”

Protocol

Alle prosedyrer som ble utført med cadaveric kaninøyne innen intakt outbred kanin hoder. Alle Institutional og nasjonale retningslinjer og bruk av forsøksdyr ble fulgt. 1. forberedelse av løsninger SMG forberedelse til TXL: Forberede 1 mL av 0,2 M konsentrasjon av natrium bikarbonat løsning (NaHCO3) løsning med 0.0165 g NaHCO3 pulver oppløst i 1 mL destillert vann. Oppløse 0.1016 mg av pulverisert natrium hydroxymethylglycinate (SMG) i 1 mL desti…

Representative Results

Termisk rødsprit temperatur (Tm) som en analysen metode for å vurdere TXL cross-linking effekt: Totalt 16 par kaninøyne ble brukt i disse eksperimentene TXL fremgangsmåten. Som en første del av denne studien, ble lokalisering av cross-linking effekten indusert av en enkelt injeksjon SMG cross-linking agent via sT plass i cadaveric kanin hodet evaluert. Denne typen eksperiment har relevans til klinisk behandling av pasienter, siden injeksjoner i flere steder kan være…

Discussion

Utført eksperimenter har vist bevis som støtter bruk av SHG signal mikroskopi som en metode for evaluering av kollagen cross-linking effekter i sclera, øke fremtidige muligheten til å bruke denne teknikken som avlytting verktøyet for cross-linking behandlinger som mål kollagen proteiner. Av notatet er et instrument allerede i klinisk bruk som potensielt kan fange SHG signalet. Selv om dette instrumentet ble hovedsakelig utformet for imaging huden menneskelige dermis, er det brukt med hell bilde hornhinnen og sclera…

Materials

MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V	EMD Millipore, Massachusetts, USA		Double distilled, deionized water. – protocol step 1.1.1
Sodium hydroxymethylglycinate	Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA		Crosslinking reagent – protocol step 1.1.2
Injection needle with luer-lock syringe	BD Eclipse, NJ, USA		Syringe for sub tenon injection. – protocol step 2.1
Rabbit head	La Granja poultry	Outbred	Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. – protocol step 2.2
Tono-pen	Reichter Technologies Depew, NY		IOP measurements – protocol step 2.4
DSC 6000 Autosampler	Perkin-Elmer Waltham, MA, USA		Thermal denaturation analyzer – protocol step 7.4
Pyris software	Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA	Ver 11.0	protocol step 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm – protocol step 8.1.1.
GenTeal	Alcon, Fort Worth, TX	B000URVDQ8	Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation – 8.1.1
Chameleon Vision II	Coherent, Santa Clara,CA, USA		Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. – protocol step 8.1.11
AttoFluor cell chamber	Thermo Fisher Scientific Inc	A7816	Fixation of the cover slip – protocol step 8.1.3
25-mm round coverslips, #1.5	Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA	GG-25-1.5	protocol step 8.1.3
Eclipse Ti-E	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		protocol step 8.1.4.
Non-descanned (NDD) GaAsP detector	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		Equipped with a 400-450 nm band pass filter – protocol step 8.1.7
A1R-MP laser scanning system	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. – protocol step 8.1.8
NIS Elements software	Nikon Instruments, Melville, NY, USA	Ver 4.3	refered to as "software" in the text – protocol step 8.1.9
Fiji/ImageJ	National Institute of Health		protocol step 9.1.2
NeuronJ	Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands		https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2
Microsoft Excel	Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA	Ver 14	protocol step 9.2.8