プールされた shRNA MeCP2 再アクティブ化非アクティブ X 染色体上の画面
Summary
小さいヘアピン RNA (shRNA) とホタルのルシフェラーゼとマウス細胞における x 染色体不活性化のレギュレータを識別するの次世代シーケンス ベースのプロトコルについて報告して、メチル CpG 結合蛋白質 2 (hygromycin 抵抗性遺伝子融合MeCP2)不活性 X 染色体の遺伝子。
Abstract
前方遺伝スクリーン、ヘテロクロマチンに挿入されたレポーター遺伝子を使用しては、モデル有機体のエピジェネティックな調節機構を調査するため広く使用されています。短いヘアピン Rna (Shrna) とクラスター化された空間定期的に短い回文繰り返し (CRISPR) などの技術は、二倍体の細胞でこのような画面を有効にしています。ここで説明の x 染色体の不活性化 (嘲りながら)、レギュレータの大規模 shRNA 画面マウス細胞株を用いたホタルのルシフェラーゼとメチル CpG 結合タンパク質の C 末端で hygromycin 抵抗性遺伝子ノックアウト 2 (MeCP2) 遺伝子非アクティブな x 染色体 (Xi)。レポーター細胞ラインの構造の再授与 hygromycin B 選択で、大きな shRNA ライブラリを選別し、ヘアピン、事後選択濃縮を使用して測定することによって、記者を再アクティブ化する私たちを有効に存続の利点次世代シーケンス。豊かなヘアピンが Xi のルシフェラーゼ レポーターを有効にする能力をテストすることによって個別に検証されます。
Introduction
1 つ女性、レット症候群、遺伝性精神障害の最も一般的なフォームMeCP2、正常な神経機能1に不可欠なタンパク質をエンコードする x 染色体遺伝子のヘテロ変異が原因です。MeCP2表現の復元だったように病1,のマウスモデルで神経学的な欠損を逆に、この疾患の治療への潜在的なアプローチは、Xi に野生型のMeCP2遺伝子の再活性化になります。2,4しますただし、メスの細胞における染色体 X 2 つのエピジェネティックなサイレンシングはしっかりと生物3,4の場合は、生涯維持と Xi 遺伝子の強力な再活性化の主要な必要があります。複数のエピジェネティックな調節経路で中断。
MeCP2のサイレンシングのメンテナンスに必要な要因を識別するために我々 は最初にMeCP2– ルシフェラーゼ – hygromycin 抵抗遺伝子融合 (MeCP2 リュック HR) を乗せて X 染色体 2 つのトランスジェニック マウス モデルを開発 (XMeCP2-LUC-HR/XMeCP2)5。不安定で機能、(XMeCP2 リュック HR/Y) hemizygous 男性で模倣した表現型のMeCP2削除、レポーター遺伝子の表現の損失で起因したことが分かったMeCP2融合コンストラクトの表現が内因性 MeCP25の式と一致するパターンで容易に検出されました。非アクティブまたはアクティブのいずれかの x 染色体の構築と不死化線維芽細胞クローンを生成し、その元表現野生型 MeCP2 およびない記者の構築; 確認逆は、後者の本当だった。Xi (「レポーター細胞」) のレポーター細胞が作成を再アクティブ化することができることを示す生物発光アッセイの活動を得られる DNA 遺伝子サイレンシング廃止に知られているエージェントを demethylating 5-アザシチジン (5 字) に露出されたとき、したがって遺伝学的スクリーニングに使用されます。
次にMeCP2のサイレンシングのレギュレータのハイスループット遺伝学的スクリーニングを行った。記者のセルライン レトロ ウイルス ライブラリを含む感染した最初 > 60,000 異なる Shrna ターゲット >6マウスのゲノム5,の中の 25,000 の遺伝子 hygromycin B 選択を。ヘアピン周波数を事前に比較したし、次世代シーケンシングによる事後選択サンプル、記者として再活性化 hygromycin B 選択成長の優位性を与えられる責任のヘアピンの濃縮の結果します。このアプローチを使用して、我々 は 30 遺伝子サイレンシング、 MeCP2の関与し、個々 のヘアピンのレポーター細胞の伝達と、ルシフェラーゼ活性測定による調査結果を確認後。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちの最近の研究6ルシフェラーゼとマウス セルラインを生成、hygromycin 抵抗性遺伝子、Xi にMeCP2を融合し、ライブラリを導入 > 60,000 Shrna ターゲット > 25,000 の遺伝子。我々 有利さを見つけて 30 遺伝子がノックダウン授与生存 hygromycin B 選択で、 MeCP2と x 染色体のサイレンシングの制御における役割を示唆しています。これらの結果はあった個々 のヘアピンで…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
優雅、スクリーンで使用される shRNA ライブラリを提供するメルボルン大学のロス ディキンズに感謝いたします。この作業によって、レット症候群の研究を信頼 (a. b.) 資金を供給されました。
Materials
| 293FT Cell Line | Invitrogen | R700-07 | |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385-100MG | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman-Coulter | A63881 | |
| Anti-MECP2 antibody | Millipore | 07-013 | |
| Collagenase | Sigma | C2674-1G | |
| Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates | Fisher Scientific | 07-200-336 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11965-092 | |
| Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) | Open Biosystems | EAV4679 | |
| Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library | Open Biosystems | RMM3796 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisherbrand | 03-600-511 | |
| HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | Or equivalent |
| Hygromycin B | Calbiochem | 400051-1MU | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Homogenous Assay for Screening Colonies |
| Luciferase Assay System | Promega | E4530 | Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins |
| Luminometer TopCount NXT | Perkin Elmer | N/A | Or similar luminometer |
| MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2001 | Use kit compatible with your equipment |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | VSV-G envelope vector |
| Polybrene | Sigma | TR-1003-G | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966-1 | |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | Packaging vector |
| Puromycin | Gibco | A11138-02 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 |
References
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
- Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome. Science. 315, 1143-1147 (2007).
- Maduro, C., de Hoon, B., Gribnau, J. Fitting the Puzzle Pieces: the Bigger Picture of XCI. Trends Biochem Sci. 41, 138-147 (2016).
- Disteche, C. M. Dosage compensation of the sex chromosomes and autosomes. Semin Cell Dev Biol. 56, 9-18 (2016).
- Wang, J., et al. Wild-type microglia do not reverse pathology in mouse models of Rett syndrome. Nature. 521, E1-E4 (2015).
- Sripathy, S., et al. Screen for reactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 1619-1624 (2017).
- Foster, S. A., Galloway, D. A. Human papillomavirus type 16 E7 alleviates a proliferation block in early passage human mammary epithelial cells. Oncogene. 12, 1773-1779 (1996).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods Mol Biol. 1318, 87-96 (2015).
- Strezoska, Z., et al. Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens. PLoS One. 7, e42341 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol. Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).
- Goto, Y., Takagi, N. Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse. Development. 125, 3353-3363 (1998).
- Csankovszki, G., Nagy, A., Jaenisch, R. Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation. J Cell Biol. 153, 773-784 (2001).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349, (2015).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521, 232-236 (2015).
- Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12591-12598 (2014).
- Minkovsky, A., et al. The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation. Epigenetics Chromatin. 7, 12 (2014).
- Minkovsky, A., et al. A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2′-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase. Epigenetics Chromatin. 8, 42 (2015).
