在非活动 X 染色体上重新激活 MeCP2 的池 shRNA 屏幕
Summary
我们报告一个小发夹 RNA (shRNA) 和下一代测序协议, 以确定在小鼠细胞系的 X 染色体失活的监管者与萤火虫荧光素酶和潮霉素抵抗基因融合到甲基 CpG 结合蛋白 2 (MeCP2)非活性 X 染色体上的基因。
Abstract
通过插入到染色质中的报告基因的正向基因筛已被广泛用于研究模型生物体的表观遗传控制机制。技术, 包括短发夹 rna (shRNAs) 和聚集定期 interspaced 短回文重复 (CRISPR) 已启用这样的屏幕在双倍哺乳动物细胞。在这里, 我们描述了一个大规模的 shRNA 屏幕, 用于调节 X 染色体失活 (XCI), 使用小鼠细胞系与萤火虫荧光素酶和潮霉素抗性基因敲在 C 终点的甲基 CpG 结合蛋白 2(MeCP2) 基因不活跃的 X 染色体 (Xi)。在潮霉素 B 选择的情况下, 重新激活该构造, 使我们能够屏蔽一个大型 shRNA 库, 并通过测量其选择后的丰富度来确定重新激活记者的发夹。下一代测序。丰富的发夹, 然后通过测试他们的能力激活的荧光素酶记者在西安单独验证。
Introduction
女性遗传性精神损害最常见的形式之一, Rett 综合症, 是由MeCP2中的异型突变引起的, X 染色体基因编码了正常神经元功能所必需的蛋白质1。治疗这种紊乱的一种潜在的方法是重新激活在 Xi 上的野生型MeCP2等位基因, 因为MeCP2表达式的恢复被证明可以逆转这种疾病的老鼠模型的神经缺陷1,2,4. 然而, 在生物体34的整个生命周期中, 女性细胞中的两个 X 染色体之一的表观遗传沉默是严格维持的, 而一个 Xi 基因的健壮重新激活可能需要一个主要多种表观遗传调控途径的中断。
为了确定维护MeCP2沉默所需的因素, 我们首先开发了一种转基因小鼠模型, 它携带MeCP2-荧光素酶-潮霉素抗性基因融合(MeCP2-LUC-HR) 对两个 x 染色体之一 (xMeCP2-LUC-HR/XMeCP2)5。虽然从融合结构中表达的MeCP2被证明是不稳定的, 并导致函数丢失, 但表型在 hemizygous 雄性 (X MeCP2-LUC-HR/Y) 中模仿 MeCP2 删除, 报告基因的表达 在与内源 MeCP25的表达式一致的模式下易于检测。然后, 我们在非活动 X 染色体上生成永生化成纤维细胞克隆, 并证实前者表达的野型 MeCP2 而非记者构造;后者的逆是真的。当暴露在已知的 DNA 去甲基化剂被称为废除基因沉默, 5-azacytidine (5-AZA), 细胞与记者在 Xi (“记者细胞”) 获得活性的生物发光检测, 表明我们的构造可以重新激活, 因此用于基因筛选。
接下来, 我们为MeCP2沉默的监管者开发了一个高通量的遗传屏幕。记者细胞线首先感染了一个包含 > 6万不同 shRNAs 靶向 > 2.5万基因的逆转录病毒库, 整个鼠标基因组5,6, 然后受到潮霉素 B 选择。用下一代测序方法比较了前、后选择样品中的发夹频率, 因为在潮霉素 B 选择的情况下, 记者重新激活赋予了增长优势, 导致了责任发夹的丰富。利用这一方法, 我们确定了30个与MeCP2沉默有关的基因, 随后通过传感与单个发夹的报告细胞并测量其荧光素酶活性来证实这一发现。
Protocol
Representative Results
Discussion
在我们最近的研究6, 我们产生了一个小鼠细胞系与荧光素酶和潮霉素抵抗基因融合到MeCP2 上的 Xi, 并转基因它与 > 6万 shRNAs 目标 > 2.5万基因的图书馆。我们发现30基因的潮霉素在 B 选择下赋予生存优势, 表明它们在控制MeCP2 和 X 染色体沉默中的作用。这些结果通过传感报告的细胞线与单独发夹和评估激活的无声荧光素酶记者证实。
由于XIST?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢墨尔本大学的罗斯 Dickins 慷慨地提供了 shRNA 图书馆在屏幕上使用。这项工作由 Rett 综合症研究信托基金资助。
Materials
| 293FT Cell Line | Invitrogen | R700-07 | |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385-100MG | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman-Coulter | A63881 | |
| Anti-MECP2 antibody | Millipore | 07-013 | |
| Collagenase | Sigma | C2674-1G | |
| Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates | Fisher Scientific | 07-200-336 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11965-092 | |
| Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) | Open Biosystems | EAV4679 | |
| Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library | Open Biosystems | RMM3796 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisherbrand | 03-600-511 | |
| HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | Or equivalent |
| Hygromycin B | Calbiochem | 400051-1MU | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Homogenous Assay for Screening Colonies |
| Luciferase Assay System | Promega | E4530 | Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins |
| Luminometer TopCount NXT | Perkin Elmer | N/A | Or similar luminometer |
| MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2001 | Use kit compatible with your equipment |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | VSV-G envelope vector |
| Polybrene | Sigma | TR-1003-G | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966-1 | |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | Packaging vector |
| Puromycin | Gibco | A11138-02 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 |
References
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