蛋白質の Qa 1 エピトープをマップするペプチド ライブラリを重複
Summary
Qa-1 (人間の HLA E) は、クラシック以外の主要な組織適合性の複雑な 1 b 分子のグループに属しています。Qa-1 結合エピトープと予防接種はティッシュ特定の免疫制御が強化され、いくつかの自己免疫疾患を改善するのに示されています。本蛋白質の Qa 1 エピトープの同定のため重複のペプチド ライブラリ戦略について述べる。
Abstract
Qa-1 (人間の HLA E) は、(MHC Ib) 分子をクラシック以外の主要な組織適合性の複雑な 1 b グループに属する。最近のデータでは、Qa 1 分子が細胞の構造と機能の整合性を調査、免疫調節の誘導、ウイルス感染に対する免疫応答を制限することにおいて重要な役割を果たすことを示唆しています。また、CD8 の Qa 1 制限の機能増強+ T 細胞エピトープを通じて予防接種がいくつかの自己免疫疾患動物モデル、例えば実験的アレルギー性脳脊髄炎、治療効果を示しています。コラーゲン誘発関節炎と非肥満の糖尿病。したがって、蛋白質の機能性 Qa 1 エピトープを効率的かつ迅速に識別できる方法のための緊急の必要性があります。ここでは、CD8 の Qa 1 制限を利用するプロトコルについて述べる+ T 細胞の蛋白質の Qa 1 エピトープを決定するための重複のペプチド (OLP) ライブラリの特定行。この OLP ライブラリを含む 15 mer 重複するペプチド、蛋白質の全体の長さをカバーする、11 のアミノ酸によって隣接するペプチドを重ねます。このプロトコルを使用して、我々 は最近ミエリン オリゴデンドロ サイト糖タンパク質 (モグ) 9 mer Qa 1 エピトープを識別しました。この新しくマップされたモグ Qa 1 エピトープはエピトープ固有の Qa 1 制限 CD8 を誘導するために示された+ T 細胞その強化されたミエリン特異免疫調節。したがって、このプロトコルは、将来における新たな標的と CD8 の Qa 1 制限の機能に便利+ T 細胞。
Introduction
Qa 1 はマウス (MHC Ib) 分子非古典的な主要な組織適合性の複雑な 1 b のグループに属しています。その人間の相同物 HLA-E のです。証拠はこれまでは、Qa 1 分子が生体の重要な機能であることを示しています。まず、Qa 1 分子構造と機能の整合性のための細胞の調査で重要な役割を果たします。この点、Qa 1 分子は、細胞の正常な機能を監視するいくつかの戦略を進化してきました。このような戦略の 1 つは、Qa 1 分子加工のリーダー ペプチド (エピトープ)、すなわちQa 1 決定修飾子 (Qdm) 小胞体1古典的 MHC Ia 分子から処理されると錯形成できます。これら後の Qa-1/Qdm の複合体は細胞の表面に表示され、アクティビティ2を殺す NK を抑制する NK 細胞の抑制性 NKG2A 受容体にバインドします。Ia MHC 分子の発現が失われた場合 (例えば悪性細胞) は2を殺す NK に敏感になります。その他の方法により、タップ (抗原処理に関連付けられているトランスポーター) に欠けている細胞の表面の新しい Qa 1/抗原複合体を形成する Qa 1 分子3および/または ERAAP (小胞体アミノペプチダーゼに関連付けられています。抗原処理)4 (両方の欠陥はしばしば悪性細胞に発生します)。これらの新しい Qa 1/抗原複合体を表現する細胞認識およびエピトープ特異 CD8 の Qa 1 制限によって除去できる+ T 細胞。第二に、Qa 1 分子免疫制御5を誘発します。この点、Qa 1/抗原複合体は、CD8 を刺激するために示されている+自己組織6,7,8 の免疫介在性損傷の防止にとって重要な細胞 (Treg) T、9,10。第三に、Qa 1 制限 CD8+ Treg 細胞はウイルス感染11に対する免疫応答を制限する示されています。
したがって、エピトープ特異 Qa 1 点 CD8 の特定豊胸+ T 細胞は異常細胞の排除、免疫制御の強化との大きさの制御可能性のある有望な戦略ウイルスによる免疫応答。一方、それかどうか決定されていない豊胸エピトープ特異 CD8 の Qa 1 制限の+ T 細胞は免疫監視を強化でき、ウイルスによる免疫応答を制限、研究所施設、その他ことが明らかQa 1 エピトープと予防接種は CD8 の Qa 1 制限の機能を増やすことが+ Treg 細胞病原性自己免疫性 cd4 陽性の特定+ T 細胞、CD4 の効率的な管理に至る+で T 細胞による自己免疫疾患、さまざまな動物モデルの実験的アレルギー性脳脊髄炎 (人間多発性硬化症の動物モデル)6,10、コラーゲン誘導関節炎 (ひと関節リウマチの動物モデル)7などと非肥満の糖尿病 (ヒト 1 型糖尿病の動物モデル)8。さらに、我々 は免疫組織固有の Qa 1 エピトープが CD8 の増強によってその組織の免疫炎症の特定のコントロールにつながることを発見した+ Treg 細胞12。前臨床試験の上記の成功が Qa 1 エピトープ免疫組織特異免疫介在性疾患の治療のため、潜在的タップの欠陥に関連付けられている他の疾患の治療のための完全な評価の必要性を示すとERAAP。
したがって、蛋白質の Qa 1 エピトープを確実かつ迅速に分析できる技術の需要があります。この点では、生物学的に重要な Qa 1 エピトープの限られた数が記載されています。これら Qa 1 エピトープのほとんどは CD8 の研究中に偶然に識別された+ T 細胞の反応惹起6、原因になるセル セル ERAAP4、欠損、タップ3欠損細胞細菌13 9。したがって、高スループット方法が定義されたタンパク質の生物学的に重要な Qa 1 エピトープの同定のため望ましいです。以下では、マップを使用して Qa 1 resrticted CD8 蛋白質の機能性 Qa 1 エピトープ重複のペプチド (OLP) ライブラリ戦略について述べる+ T 細胞ライン OLP プール (OLP_pool) 蛋白質のために特定します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、蛋白質の Qa 1 エピトープの分析のためのプロトコルを説明しました。このプロトコルに関連していくつかの他の方法は既に報告もしました。まず、同種の CD8+ T 細胞とクローンは Qdm1の識別のために使用されました。第二に、Qdm の解析から推定される Qa-1 結合モチーフは HSP60p216 224 と TCRBV8.1 エピトープ9,18の同?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
彼女の技術支援とこの原稿の準備、ペネロペ ガルシアに感謝しますこの作品は、(681205-2967) ロマリンダ大学医学部から研究イノベーション助成金 (リグ) と XT に国民の多数硬化の社会 (PP1685) からパイロットの助成金によって支持されました。
Materials
| The protein to be analyzed | N/A | N/A | Sequence of the protein can be obtained from NCBI |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | Cat#: D2650 SIGMA | DMSO should be sterile and cell culture tested. |
| Kb-/-Db-/- mice | The Lackson Laboratory | Stock#: 019995 | We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore. |
| AIM V Serum Free Medium | ThermoFisher Scientific | Cat#: 12055091 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11333D | |
| Bio-Gel P-100 | Bio-Rad | Cat#: 150-4171 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| Trasfer pipette | Globe Scientific | Mfg#: 137238 | |
| Murine M-CSF | PeproTech | Cat#: 315-02 | |
| 48-well tissue culture plates | USA Scientific | Cat#: CC7682-7548 | |
| Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom | Sigma-Aldrich | Cat#: Z372129 Sigma | |
| 1ml deep 06-well PP plate, sterile | USA Scientific | Item#: 1896-1110 | |
| Recombinant murine IL-2 | PeproTech | Cat#: 212-12 | |
| Recombinant murine IL-7 | PeproTech | Cat#L: 217-17 | |
| Capture anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| ELISPOT plate | Sigma-Aldrich | Cat#: S2EM004M99 | |
| C1R | ATCC | Cat#: ATCC CRL-1993 | |
| C1R.Qa-1b | Custom made (GenBank access#: NM_010398.3) | ||
| Qa-1 lentiviral vector | GeneCopoeia | Product#: Mm02955 | |
| Detection anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | Cat#: P9416 | |
| Streptavidin-HRP | BD Biosciences | Cat#: BD557630 | |
| AEC substrate | BD Biosciences | Cat#: 551951 | |
| ImmunoSpot Analyzer | ImmunoSpot | Any immunoSpot analyer should work for this purpose. |
References
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