Перекрывающиеся пептид библиотека для сопоставления Qa-1 Epitopes в протеине
Summary
QA-1 (HLA-E в человека) принадлежит к группе неклассических гистосовместимости 1b сложных молекул. Иммунизации с КК-1-привязки epitopes было показано для укрепления тканей специфические иммунные регулирования и улучшения несколько аутоиммунных заболеваний. Здесь мы описываем перекрывающихся пептид библиотека стратегии для идентификации Qa-1 epitopes в протеине.
Abstract
QA-1 (HLA-E в человека) принадлежит к группе комплекс 1В неклассических гистосовместимости (MHC-Ib) молекул. Последние данные показывают, что КК-1 молекулы играют важную роль в съемки клетки для структурной и функциональной целостности, вызывая иммунную регулирование и ограничение иммунного ответа к вирусным инфекциям. Кроме того функциональные увеличения Qa-1-ограничено CD8+ T-клеток через epitope иммунизации показал терапевтические эффекты в несколько аутоиммунных заболеваний животных моделей, например экспериментально аллергический энцефаломиелит, Коллаген индуцированной артрит и не страдающих ожирением диабетом. Таким образом существует настоятельная необходимость для метода, который можно быстро и эффективно выявлять функциональных эпитопов Qa-1 в протеине. Здесь мы описываем протокол, который использует Qa-1-ограничено CD8+ Т-клеток линии конкретных перекрывающихся библиотеки пептида (OLP) для определения Qa-1 epitopes в протеине. Это OLP библиотека содержит 15-mer перекрывающихся пептиды, которые охватывают всю длину белка, и перекрывать прилегающие пептиды по 11 аминокислоты. Используя этот протокол, мы недавно выявленных epitope Qa-1 9-mer в миелина Олигодендроциты гликопротеина (мог). Это вновь сопоставленного epitope MOG Qa-1 был показан побудить эпитопа специфики, Qa-1-ограничено CD8 клетки+ T что расширенной миелина специфические иммунные регулирование. Таким образом, этот протокол является полезным для будущего расследования новых целей и функций Qa-1-ограничено CD8+ T клетки.
Introduction
QA-1 принадлежит к группе неклассических гистосовместимости комплекс 1В (MHC-Ib) молекул в мышах. Его человеческие гомолога является HLA-E. Предыдущие доказательства свидетельствуют, что КК-1 молекулы имеют важные биологические функции. Во-первых Qa-1 молекулы играют важную роль в обследовании клетки для структурной и функциональной целостности. В этой связи Qa-1 молекулы развивались несколько стратегий для наблюдения за нормальное функционирование клетки. Одна такая стратегия позволяет Qa-1 молекул образует комплексы с обработанной лидер пептид (epitope), т.е. КК-1 определяющим модификатор (Qdm), который обрабатывается от классической молекул MHC-Ia в эндоплазматический ретикулум1. Эти комплексы Qa-1/Qdm позднее отображения на поверхности клетки и привязку к тормозной NKG2A рецепторов на клетки подавляют НК убийство деятельности2. Если выражение молекул MHC-Ia теряется, ячейки (например злокачественных клеток) становится чувствительным к НК убийство2. Эта стратегия позволяет Qa-1 молекулы для формирования новых комплексов Qa-1/epitope на поверхности клеток, что является несовершенным в TAP (транспортер, связанные с обработкой антигена)3 и/или ERAAP (aminopeptidase эндоплазматического ретикулума, связанные с антиген обработка)4 (оба недостатки часто происходят в злокачественных клеток). Ячейка, которая выражает эти новые комплексы Qa-1/epitope можно затем признал и устраняется epitope специфичные Qa-1-ограничено CD8+ T клетки. Во-вторых Qa-1 молекулы побудить иммунной правила5. В этой связи Qa-1/epitope комплексов было показано, чтобы стимулировать CD8+ регулирования T (Treg) клетки, которые имеют важное значение для предотвращения иммунной опосредованного ущерба self ткани6,,78 ,9,10. В-третьих Qa-1-ограничено CD8 Treg клеток было показано ограничение иммунного ответа против вирусной инфекции11+ .
Таким образом конкретные увеличения CD8 эпитопа специфики Qa-1-restrictred+ T клетки является потенциально перспективной стратегией для ликвидации аномальных клеток, для повышения иммунной регуляции и контроля за масштабами вирус индуцированной иммунных реакций. Хотя он не был определен ли увеличение epitope конкретных Qa-1-ограничено CD8+ T клетки могут повысить иммунной наблюдения и ограничить вирус индуцированной иммунных реакций, наши лаборатории и другие четко показали, что иммунизации с epitopes Qa-1 можно дополнить функции Qa-1-ограничено CD8+ Treg для патогенных аутоиммунные CD4 клеток конкретных+ T клеток, приводит к эффективного контроля над CD4+ Т клеток опосредованной аутоиммунных заболеваний в разнообразие животных моделей таких экспериментальных аллергический энцефаломиелит (животной модели человеческого рассеянный склероз)6,10,7-индуцированной коллагена артрит (животной модели человеческого ревматоидный артрит), и 8-ожирением диабетом (животной модели человеческого типа 1 диабетом). Кроме того, мы обнаружили, что иммунизации с epitope Qa-1 ткани конкретных приводит к конкретным контроля иммунной опосредованного воспаления в этой ткани путем увеличения CD8 клетки+ Treg12. Выше успехи доклинические исследования указывают на необходимость всесторонней оценки Qa-1 epitope иммунизации для лечения иммунной системы заболеваний тканей конкретным и потенциально для лечения других заболеваний, связанных с недостатками в водопроводной и ERAAP.
Соответственно существует спрос на технологию, которая может быстро и надежно анализировать Qa-1 epitopes в протеине. В этой связи был описан ограниченное количество биологически важных epitopes Qa-1. Большинство этих epitopes Qa-1 были определены интуитивно во время изучения CD8+ T мобильных ответы на бактерии13, дефицит крана3клетки, клетки в ERAAP4и клетки, которые вызывают ЕАЕ6, 9. Таким образом высокая пропускная способность технику желательно для идентификации биологически важных epitopes Qa-1 в определенных белков. Ниже мы описываем перекрывающихся пептида (OLP) библиотека стратегию, которая сопоставляет функциональных эпитопов Qa-1 в протеине с помощью Qa-1-ограниченной CD8+ Т-клеток линии для OLP бассейн (OLP_pool) белка.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описали протокол для анализа Qa-1 epitopes в протеине. В отношении настоящего протокола ряд других стратегий также сообщалось ранее. Во-первых, аллогенной CD8+ Т-клеточных линий и клоны были использованы для идентификации Qdm1. Во-вторых предполагаемый мотив Qa-1-привяз…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Пенелопа Гарсия за ее технической помощи и подготовки этой рукописи. Эта работа была поддержана исследований инноваций Грант (Рог) от Департамента медицины в университете Loma Linda (681205-2967) и экспериментального грант от Национальное общество рассеянного склероза (PP1685) до XT.
Materials
| The protein to be analyzed | N/A | N/A | Sequence of the protein can be obtained from NCBI |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | Cat#: D2650 SIGMA | DMSO should be sterile and cell culture tested. |
| Kb-/-Db-/- mice | The Lackson Laboratory | Stock#: 019995 | We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore. |
| AIM V Serum Free Medium | ThermoFisher Scientific | Cat#: 12055091 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11333D | |
| Bio-Gel P-100 | Bio-Rad | Cat#: 150-4171 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| Trasfer pipette | Globe Scientific | Mfg#: 137238 | |
| Murine M-CSF | PeproTech | Cat#: 315-02 | |
| 48-well tissue culture plates | USA Scientific | Cat#: CC7682-7548 | |
| Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom | Sigma-Aldrich | Cat#: Z372129 Sigma | |
| 1ml deep 06-well PP plate, sterile | USA Scientific | Item#: 1896-1110 | |
| Recombinant murine IL-2 | PeproTech | Cat#: 212-12 | |
| Recombinant murine IL-7 | PeproTech | Cat#L: 217-17 | |
| Capture anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| ELISPOT plate | Sigma-Aldrich | Cat#: S2EM004M99 | |
| C1R | ATCC | Cat#: ATCC CRL-1993 | |
| C1R.Qa-1b | Custom made (GenBank access#: NM_010398.3) | ||
| Qa-1 lentiviral vector | GeneCopoeia | Product#: Mm02955 | |
| Detection anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | Cat#: P9416 | |
| Streptavidin-HRP | BD Biosciences | Cat#: BD557630 | |
| AEC substrate | BD Biosciences | Cat#: 551951 | |
| ImmunoSpot Analyzer | ImmunoSpot | Any immunoSpot analyer should work for this purpose. |
References
- Aldrich, C. J., et al. Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen. Cell. 79 (4), 649-658 (1994).
- Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b). J Exp Med. 188 (10), 1841-1848 (1998).
- Oliveira, C. C., et al. The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects. J Exp Med. 207 (1), 207-221 (2010).
- Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum. Nat Immunol. 13 (6), 579-586 (2012).
- Hu, D., et al. Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice. Nat Immunol. 5 (5), 516-523 (2004).
- Tang, X., et al. Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells. J Immunol. 177 (11), 7645-7655 (2006).
- Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells. J Clin Invest. 123 (3), 1382-1389 (2013).
- Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 534-539 (2009).
- Panoutsakopoulou, V., et al. Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes. J Clin Invest. 113 (8), 1218-1224 (2004).
- Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 178 (10), 6043-6050 (2007).
- Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21089-21094 (2013).
- Wang, X., et al. Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Sci Rep. 6, 36064 (2016).
- Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway. Infect Immun. 72 (5), 2843-2849 (2004).
- Xu, W., et al. The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses. PLoS One. 8 (3), e59210 (2013).
- Schumacher, T. N., et al. Peptide selection by MHC class I molecules. Nature. 350 (6320), 703-706 (1991).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Guo, H. C., et al. Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle. Nature. 360 (6402), 364-366 (1992).
- Soloski, M. J., Metcalf, E. S. The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity. Microbes Infect. 3 (14-15), 1249-1259 (2001).
- Smith, T. R., et al. Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties. J Immunol. 182 (11), 6959-6968 (2009).
- Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP. Malar J. 15, 457 (2016).
- Kambayashi, T., et al. The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes. J Immunol. 172 (3), 1661-1669 (2004).
