Överlappande peptid-bibliotek för att mappa Qa-1 epitoper i ett Protein
Summary
QA-1 (HLA-E i mänskliga) tillhör en grupp av icke-klassiska stora histocompatibility komplex 1b molekyler. Immunisering med Qa-1-bindning epitoper har visat sig öka vävnadsspecifika immunreglering och lindra flera autoimmuna sjukdomar. Detta dokument beskriver vi en överlappande peptid Biblioteksstrategi för identifiering av Qa-1 epitoper i ett protein.
Abstract
QA-1 (HLA-E i mänskliga) tillhör en grupp av icke-klassiska stora histocompatibility komplex 1b (MHC-Ib) molekyler. Senaste data tyder på att Qa-1 molekyler spelar viktiga roller i lantmäteri celler för strukturella och funktionella integritet, förmå immunreglering och begränsa immunsvar mot virusinfektioner. Dessutom, funktionell förstärkning av Qa-1-begränsat CD8+ T celler genom epitop immunisering har visat effekter i flera autoimmun sjukdom djurmodeller, e.g. experimentell allergisk encefalomyelit, kollagen-inducerad artrit, och icke-feta diabetes. Därför finns det ett brådskande behov av en metod som kan snabbt och effektivt identifiera funktionella Qa-1 epitoper i ett protein. Här beskriver vi ett protokoll som använder Qa-1-begränsat CD8+ T cell linjer specifika för ett överlappande peptid (OLP)-bibliotek för att bestämma Qa-1 epitoper i ett protein. Detta OLP bibliotek innehåller 15-mer överlappande peptider som täcker hela längd av ett protein, och intilliggande peptider överlappning av 11 aminosyror. Använder det här protokollet, vi har nyligen identifierat en 9-mer Qa-1 epitop i myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG). Detta nyligen mappad MOG Qa-1 epitop visades att inducera epitop-specifik, Qa-1-begränsat CD8+ T cells förbättrade myelin-specifik immun förordningen. Detta protokoll är därför användbart för framtida utredning av nya mål och funktioner av Qa-1-begränsat CD8+ T celler.
Introduction
QA-1 tillhör en grupp av icke-klassiska stora histocompatibility komplex 1b (MHC-Ib) molekyler i möss. Dess mänskliga homolog är HLA-E. Tidigare bevis har visat att Qa-1 molekyler har viktiga biologiska funktioner. För det första, Qa-1 molekyler spelar en viktig roll i lantmäteri celler för strukturella och funktionella integritet. Qa-1 molekyler har i detta avseende utvecklats flera strategier för att övervaka den normala funktionen av en cell. En sådan strategi kan Qa-1 molekyler att bilda komplex med en bearbetade ledare peptid (epitop), dvs den Qa-1 avgörande modifierare (Qdm) som bearbetas från klassiskt MHC-Ia molekyler i endoplasmatiska retikulet1. Dessa Qa-1/Qdm-komplex senare Visa på ytan av en cell och binder till hämmande NKG2A receptorer på NK celler att hämma NK döda aktivitet2. Om uttrycket av MHC-Ia molekyler bryts, blir en cell (t.ex. en elakartad cell) känslig för NK döda2. Den andra strategin gör det möjligt för Qa-1 molekyler att bilda nya Qa-1/epitop komplex på ytan av en cell som är bristfällig i TAP (transportör är associerad med antigen bearbetning)3 och/eller ERAAP (endoplasmatiska nätverket aminopeptidase associerade med antigen bearbetning)4 (båda brister ofta förekommer i maligna celler). Cellen som uttrycker dessa nya Qa-1/epitop komplex kan då identifieras och elimineras genom de epitop-specifika Qa-1-begränsat CD8+ T celler. För det andra, Qa-1 molekyler inducerar immunreglering5. I detta avseende, Qa-1/epitop komplex har visat sig stimulera CD8+ regulatoriska T (Treg)-celler som är viktiga för förhindrandet av immunmedierade skada av self-vävnader6,7,8 ,9,10. För det tredje, Qa-1-begränsat CD8+ Treg celler har visat att begränsa immunsvar mot virusinfektion11.
Därför viss förstärkning av epitop-specifika CD8 Qa-1-restrictred+ T celler är en potentiellt lovande strategi för eliminering av onormala celler, om förbättring av immunreglering och för kontroll av omfattningen av virus-inducerad immunsvar. Samtidigt som det inte har bestämts om förstärkning av epitop-specifika Qa-1-begränsat CD8+ T celler kan förbättra immun övervakning och begränsa virus-inducerad immunsvar, våra laboratorier och andra har tydligt visat att immunisering med Qa-1 epitoper kan utöka funktionen av Qa-1-begränsat CD8+ Treg-celler specifika för patogena autoimmuna CD4+ T celler, vilket leder till effektiv kontroll av CD4+ T cell-medierade autoimmuna sjukdomar i en mängd djur modeller såsom experimentell allergisk encefalomyelit (en djurmodell av mänskliga multipel skleros)6,10, kollagen-inducerad artrit (en djurmodell av mänskliga reumatoid artrit)7, och icke-feta diabetes (en djurmodell av mänskliga typ 1-diabetes)8. Dessutom har vi upptäckt att immunisering med en vävnadsspecifika Qa-1 epitop leder till specifik kontroll av immunmedierad inflammation i denna vävnad genom förstärkning av CD8+ Treg-celler12. De ovanstående framgångarna i prekliniska studier indikerar ett behov av en fullständig utvärdering av Qa-1 epitop immunisering för behandling av vävnadsspecifika immunmedierade sjukdomar och potentiellt för terapin av andra sjukdomar förknippade med brister i tryck och ERAAP.
Därmed, det finns en efterfrågan på en teknik som kan tillförlitligt och snabbt analysera Qa-1 epitoper i ett protein. I detta sammanhang har ett begränsat antal biologiskt viktiga Qa-1 epitoper beskrivits. De flesta av dessa Qa-1 epitoper identifierades serendipitously under studien av CD8+ T cell Svaren till bakterier13, celler bristfällig i tryck3, celler bristfällig i ERAAP4och cellerna som orsakar EAE6, 9. En hög genomströmning teknik är därför önskvärt för identifiering av biologiskt viktiga Qa-1 epitoper i ett definierat protein. I följande beskriver vi en överlappande peptid (OLP) Biblioteksstrategi som kartor funktionella Qa-1 epitoper i ett protein med Qa-1-resrticted CD8+ T cell linjer specifika för OLP pool (OLP_pool) av ett protein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här har vi beskrivit ett protokoll för att analysera Qa-1 epitoper i ett protein. I förhållande till detta protokoll rapporterades också flera andra strategier tidigare. Första, allogen CD8+ T cellinjer och kloner användes för identifiering av Qdm1. För det andra, en förmodad Qa-1-bindning motiv från analysen av Qdm användes för identifiering av den HSP60p216-224 och TCRBV8.1 epitop9,18. Tredje, enskilda överlappan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Penelope Garcia för hennes tekniskt bistånd och beredning av detta manuskript. Detta arbete stöds av en forskning Innovation Grant (RIG) från Institutionen för medicin vid Loma Linda University (681205-2967) och en pilot bidrag från nationell multipelskleros samfund (PP1685) till XT.
Materials
| The protein to be analyzed | N/A | N/A | Sequence of the protein can be obtained from NCBI |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | Cat#: D2650 SIGMA | DMSO should be sterile and cell culture tested. |
| Kb-/-Db-/- mice | The Lackson Laboratory | Stock#: 019995 | We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore. |
| AIM V Serum Free Medium | ThermoFisher Scientific | Cat#: 12055091 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11333D | |
| Bio-Gel P-100 | Bio-Rad | Cat#: 150-4171 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| Trasfer pipette | Globe Scientific | Mfg#: 137238 | |
| Murine M-CSF | PeproTech | Cat#: 315-02 | |
| 48-well tissue culture plates | USA Scientific | Cat#: CC7682-7548 | |
| Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom | Sigma-Aldrich | Cat#: Z372129 Sigma | |
| 1ml deep 06-well PP plate, sterile | USA Scientific | Item#: 1896-1110 | |
| Recombinant murine IL-2 | PeproTech | Cat#: 212-12 | |
| Recombinant murine IL-7 | PeproTech | Cat#L: 217-17 | |
| Capture anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| ELISPOT plate | Sigma-Aldrich | Cat#: S2EM004M99 | |
| C1R | ATCC | Cat#: ATCC CRL-1993 | |
| C1R.Qa-1b | Custom made (GenBank access#: NM_010398.3) | ||
| Qa-1 lentiviral vector | GeneCopoeia | Product#: Mm02955 | |
| Detection anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | Cat#: P9416 | |
| Streptavidin-HRP | BD Biosciences | Cat#: BD557630 | |
| AEC substrate | BD Biosciences | Cat#: 551951 | |
| ImmunoSpot Analyzer | ImmunoSpot | Any immunoSpot analyer should work for this purpose. |
References
- Aldrich, C. J., et al. Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen. Cell. 79 (4), 649-658 (1994).
- Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b). J Exp Med. 188 (10), 1841-1848 (1998).
- Oliveira, C. C., et al. The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects. J Exp Med. 207 (1), 207-221 (2010).
- Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum. Nat Immunol. 13 (6), 579-586 (2012).
- Hu, D., et al. Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice. Nat Immunol. 5 (5), 516-523 (2004).
- Tang, X., et al. Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells. J Immunol. 177 (11), 7645-7655 (2006).
- Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells. J Clin Invest. 123 (3), 1382-1389 (2013).
- Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 534-539 (2009).
- Panoutsakopoulou, V., et al. Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes. J Clin Invest. 113 (8), 1218-1224 (2004).
- Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 178 (10), 6043-6050 (2007).
- Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21089-21094 (2013).
- Wang, X., et al. Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Sci Rep. 6, 36064 (2016).
- Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway. Infect Immun. 72 (5), 2843-2849 (2004).
- Xu, W., et al. The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses. PLoS One. 8 (3), e59210 (2013).
- Schumacher, T. N., et al. Peptide selection by MHC class I molecules. Nature. 350 (6320), 703-706 (1991).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Guo, H. C., et al. Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle. Nature. 360 (6402), 364-366 (1992).
- Soloski, M. J., Metcalf, E. S. The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity. Microbes Infect. 3 (14-15), 1249-1259 (2001).
- Smith, T. R., et al. Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties. J Immunol. 182 (11), 6959-6968 (2009).
- Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP. Malar J. 15, 457 (2016).
- Kambayashi, T., et al. The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes. J Immunol. 172 (3), 1661-1669 (2004).
