Beredning av primär akut lymfatisk leukemiceller i olika cellcykelns faser av Centrifugal Elutriation
Summary
Det här protokollet beskriver användningen av centrifugal elutriation att skilja primär akut lymfatisk leukemiceller i olika cellcykelns faser.
Abstract
Förmågan att synkronisera celler har varit centralt för avancerad vår förståelse av cellcykeln förordning. Vanliga tekniker inkluderar serum deprivation; kemikalier som arrestera celler på olika cellcykelns faser; eller användning av mitotiska shake-off som utnyttjar deras nedsatt följsamhet. Alla dessa har dock nackdelar. Till exempel fungerar serum svält bra för normala celler, men mindre väl för tumörceller med komprometterad cellcykeln kontrollpunkter på grund av onkogen aktivering eller tumör suppressor förlust. Likaså kan kemiskt behandlat cellpopulationer harbor läkemedelsinducerad skador och Visa stress-relaterade förändringar. En teknik som kringgår dessa problem är hydromassagefunktion centrifugal elutriation (CCE), där celler utsätts för två motpoler, centrifugalkraft och vätska hastighet, vilket resulterar i separation av celler på grundval av storlek och täthet. Eftersom celler framåt genom cykeln vanligtvis förstora, kan CCE användas för att separera celler i olika cellcykelns faser. Här tillämpar vi denna teknik till primär akut lymfatisk leukemiceller. Under optimala förhållanden, kan en i huvudsak ren population av celler i G1-fasen och en höganrikat population av celler i G2/M faser erhållas i utmärkt avkastning. Dessa cellpopulationer är idealiska för att studera cellcykeln-beroende verkningsmekanismer av cytostatika och andra applikationer. Vi också visa hur ändringar till standardförfarandet kan leda till suboptimalt prestanda och diskutera begränsningarna av tekniken. Den detaljerade metod presenteras bör underlätta tillämpningen och utforskning av tekniken till andra typer av celler.
Introduction
Odlade celler växer vanligtvis asynkront och enskilda celler är närvarande i olika faser av cellcykeln. Vissa organismer uppvisar naturligt synkron cell cykler eller kan synkroniseras av specifika fysiologiska stimuli. Till exempel atomkärnor inom giant plasmodia av slem mögel Physarum polycephalum dela upp i en mycket synkron mode1och celler av gröna alger Desmodesmus quadricauda kan synkroniseras av omväxlande ljusa och mörka perioderna2. Medan sådana organismer erbjuder unik experimental attribut, modell de otillräckligt komplexiteten i däggdjursceller. Förmågan att artificiellt synkronisera däggdjursceller populationer har varit centralt för vår förståelse av cellcykeln förordning och den molekylära basen för cellcykeln kontrollpunkter. Gemensamma metoder inkluderar serum deprivation, kemiska block och utgåva eller utnyttja fysiska egenskaper3,4. Återkallande av serum orsakar ofta celler att ange rofylld och nytt tillägg av serum främjar cellcykeln reentryen in i G1 fas5. Kemiska hämmare inkluderar ämnen såsom överflödig tymidin eller hydroxiurea som blockerar celler vid G1/S gränsen eller mikrotubulära hämmare som vanligtvis gripa celler i M fas3,4. Metoder som utnyttjar fysiska egenskaper inkluderar mitotiska shake-off som kan användas för att berika för mitotiska celler eftersom de är mindre vidhäftande än interphase celler6. Alla dessa tekniker har dock eventuella nackdelar. Exempelvis upprätthålla inte alla celltyper livskraften i avsaknad av serum eller förekomsten av kemiska hämmare och avkastningen av celler efter mitotiska shake-off är begränsad utan föregående synkronisering med mitotiska hämmare.
Med undantag för tidig embryonal cell cykler, där cellerna minskar successivt i storlek, när de delar7, de flesta celler framåt genom cykeln genomgå tillväxtfaser och bli större. Detta boende är utnyttjas i tekniken med hydromassagefunktion centrifugal elutriation (CCE), som kan användas för att separera celler skiljer sig i storlek och därmed i cellcykeln fas8,9. Under CCE, cellerna är under inflytande av två motpoler: centrifugalkraft, som driver cellerna från axeln av rotation, och vätska hastighet (hydromassagefunktion), som driver cellerna mot axeln av rotation (figur 1). Celler i elutriation kammaren nå en equilibrium placerar där dessa krafter är lika. De huvudfaktorer som dikterar det equilibrium placerar var cell diameter och densitet. Som flödet klassar av buffertlösningen ökas och hydromassagefunktion drar kraften uppväger centrifugalkraften, ett nytt jämviktsläge är etablerat, orsakar en förändring i position av celler inne i kammaren. Alla celler är skiftat mot avfarten kammare, vilket resulterar i mindre företag lämna kammaren först, medan de större cellerna bo i kammaren tills hydromassagefunktion är ökat tillräckligt för att främja deras utgång. Cellerna flyr elutriation kammaren med på varandra följande höjningar hydromassagefunktion ränta kan samlas i särskilda fraktioner och respektive fraktion innehåller celler med sekventiellt öka storlekar. Istället för att genomföra elutriation med en stegvis ökning hydromassagefunktion rate, kommer sekventiell minskningar av centrifugalkraft genom att minska centrifugeringsvarvtal åstadkomma samma resultat. Elutriation kräver optimering beroende på celltyp, elutriation buffert anställd och den specifika apparat som används. Graden av sedimentering av celler under dessa förhållanden bäst beskrivs av Stokes lag: SV = [d2(ρp– ρm) / 18η] .ω2r, där SV = sedimentering hastighet; d = diameter på partikeln; Ρp = densiteten av partikeln; Ρm = densiteten av bufferten; Η = viskositet av bufferten; Ω = vinkelhastigheten rotorns; och r = radiell position av partikeln. Således, SV är proportionell mot cell diameter och täthet, och eftersom diameter är upphöjt till andra, det bidrar mer påtagligt än densitet som är allmänt konstant genom cellcykeln.
En viktig fördel med CCE är att cellerna inte utsätts för hårda förhållanden av kemisk behandling eller näringsmässiga frihetsberövande och kan återvinnas i utmärkt avkastning i huvudsak ostörda. Ett krav är att cellerna i fråga genomgår en betydande ökning i diameter, av minst 30%, som de korsa cellcykeln. Den största nackdelen är kostnaden för den specialiserade centrifug, rotor och tillbehör. Förmågan att förbereda celler berikas i specifika cellcykelns faser av CCE har dock underlättat cellcykeln forskning i organismer från jäst till däggdjursceller9,10. Dessutom utökar senaste framstegen användningsområdena till avskiljandet av celler från friska kontra cancervävnaden, separation av olika celltyper i heterogena blandningar, och att produktionen av specifika celltyper för immunterapi9.
Vårt stora intresse har varit att förstå verkningsmekanismen av mikrotubuli inriktning ämnen (MTA) såsom vincaalkaloider och taxaner. Dessa droger var tänkt att handla uteslutande i Mitos, blockerar spindeln mikrotubulära funktion11,12, men nyligen tyder de kan också inriktas på interphase mikrotubuli13,14. Vi rapporterade nyligen att primär akut lymfatisk leukemi (ALL) celler genomgå död i antingen den G1-fasen eller i M fas när de behandlas med vinkristin och andra MTAs i cellcykeln-beroende sätt15. Förmågan att separera alla celler i olika cellcykelns faser av CCE bidrog att nå denna slutsats. I denna artikel, vi beskriva de tekniska detaljerna och erbjuder praktiska tips för tillämpningen av CCE till utarbetandet av primära alla celler i olika cellcykelns faser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har beskrivit en metod för att erhålla primära alla celler i olika faser av cellcykeln använder CCE. Under optimala förhållanden en i huvudsak ren population av celler i G1-fasen och en höganrikat population av celler i G2/M faser kan lätt erhållas i utmärkt avkastning och celler höganrikat i S fas kan även erhållas om så önskas. Resultaten presenteras här erhölls med en primär alla kultur (särskilt ALL-5), och i huvudsak identiska resultat har erhållits med en oberoende kultur, ALL-2<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av NIH CA109821 (till TCC). Vi tackar Beckman-Coulter för att generöst tillhandahålla medel för att täcka kostnader för publikation och tekniskt bistånd i set-up och driften av elutriation systemet. Vi tackar Dr. Fred Falkenburg för att ge inledande primära alla kulturer.
Materials
| Hanks' balanced salt solution | Lonza | 10-508Q | 1 L bottle |
| Fetal Plus bovine serum | Atlas Biologicals | FP-0500-A | 500 mL bottle |
| 2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt | Acros Organics | 212-672-4 | 100 g powder |
| 50 mL concial tubes | Denville Scientifics | C1062-P | 500/case |
| PES Membrane 0.22 µm filter unit | Millipore | SLGP033RB | 250/pack |
| Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD – 50/60 Hz, 200/208/240V | Beckman Coulter | B14544 | centrifuge compatible with elutriation system |
| JE 5.0 elutriator rotor kit | Beckman Coulter | 356900 | rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly |
| Chamber, standard, 4-mL, "A" | Beckman Coulter | 356943 | standard elutriation chamber |
| Masterflex L/S Easy-Load pump head | Cole-Parmer | EW-07518-10 | |
| Masterflex L/S Variable-Speed Drive | Cole-Parmer | EW-07528-10 | |
| Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 | Cole-Parmer | EW-96420-16 | |
| 25 G x 1.5 Precision Glide needle | BD | 305127 | sterile, single-use needles |
| 10 mL Luer-Lok syringe | BD | 309604 | sterile, single-use syringes |
| Vi-Cell XR | Beckman Coulter | 383556 | |
| PI/RNase staining buffer | BD Pharmingen | 550825 | propidium iodide/RNase staining buffer |
| cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | |
| cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20044 | |
| P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 8516s | |
| GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 2118s | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6516 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6515 |
References
- Beach, D., Piper, M., Shall, S. Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum. Exp cell res. 129, 211-221 (1980).
- Sevcikova, T., et al. Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda. FEBS letters. 587, 743-748 (2013).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat protoc. 8, 602-626 (2013).
- Banfalvi, G. Overview of cell synchronization. Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).
- Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation. Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).
- Dulla, K., Margalef, A. S. Large-Scale Mitotic Cell Synchronization. Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).
- Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat protoc. 3, 663-673 (2008).
- Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments. Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).
- Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. Synchronization of Yeast. Meth mol. 1524, 215-242 (2017).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).
- Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell death diff. 19, 369-377 (2012).
- Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors. Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).
- Furst, R., Vollmar, A. M. A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment. Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).
- Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells. Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).
- Nijmeijer, B. A., et al. Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors. Exp hematol. 37, 376-385 (2009).
- Knudsen, E. S., Wang, J. Y. Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation. Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).
- Malumbres, M., Barbacid, M. Mammalian cyclin-dependent kinases. Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).
- Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1. Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).
- Sen, S., et al. Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).
- Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells. eLife. 4, (2015).
