기질 자체 히드로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 응용 프로그램에 대 한 조립으로 인간의 심장 조직 처리

Summary

이 프로토콜의 세포 외 기질 구성 요소를 유지 하면서 인간의 심근의 완전 한 decellularization에 설명 합니다. 더 미와 cytoprotective 자가 조립 하이드로 겔의 생산에서 기질 결과의 처리.

Abstract

Acellular 기질 준비 세포-매트릭스 상호 작용을 공부 하는 데 유용 하 고 재생 세포 치료 응용 프로그램을 용이 하 게. 여러 상업 기질 제품 hydrogels 또는 막, 사용할 수 있지만 이러한 조직 관련 생물 활성을가지고 있지 않습니다. 불가능 하기 때문에 관류 decellularization 일반적으로 인간의 심장 조직으로, 우리는 3 단계 집중 decellularization 프로세스를 개발 했다. 인간의 심근 조각 수술 중 조달 먼저 세제 무료 hyperosmolar 세포의 용 해 버퍼, 이온 세제, 나트륨 라우릴 황산 염와 부 화 다음으로 취급 되 고 과정의 본질적인 DNase 활동을 이용 하 여 완료 되 면 태아 둔감 한 혈 청입니다. 이 기술은 결과 심장 세포 외 매트릭스의 셀 무료 시트에 주로 섬유 조직 아키텍처 biopolymer 구성 유지는 심장 세포 인구를 pluripotent 줄기 특정 환경 단서를 제공 하기 위해 표시 했다 셀입니다. 심장 세포 외 기질 시트 다음 추가 추가 화학 수정 없이 microparticle 분말으로 처리 하거나 수, 단기 펩 신 소화를 통해와 자가 조립 심장 세포 외 기질 히드로로 보존 bioactivity입니다.

Introduction

세포 외 기질 (ECM) 뿐만 아니라 구조 지원 하지만 생물 학적 세포에 대 한 중요 및 조직 기능¹을 제공 합니다. 에, ECM 등 섬유 증, 염증, 신생, cardiomyocyte 수축 기능 및 생존 능력, 주민 조상 세포 운명 pathophysiologic 응답의 규칙에 참여합니다. 그것의 기본 구성 요소-섬유 glycoproteins, 있다, proteoglycans-분 비 성장 인자, cytokines, 및 포함 하는 핵 산 및 단백질^2,3막 소포를 포함 합니다.

그것은 최근에 분명 acellular ECM 준비 하지만 공부 뿐만 아니라 잠재적인 치료 셀 기반 응용 프로그램에 대 한 세포-매트릭스 상호 작용에 대 한 귀중 한 되고있다. 치료 셀 제품 또는 설계 조직에 적절 한 환경을 제공의 중요성은 이제 널리 인정 했다. 정의 된 biopolymeric hydrogels^4,,56 또는 단백질 칵테일 murine 육 종 세포....

Protocol

연구 프로토콜은 헬싱키의 선언에 명시 된 윤리 원칙을 준수 하 고 Charité 의과대학의 제도적 검토 보드 및 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 제공 하는 모든 환자, 실험 연구에 대 한 심 혼 직물의 사용에 대 한 동의 작성.

1입니다. 단면에 대 한 인간의 심근의 준비

1. 왼쪽된 심 실 심근을 얻기 (크기는 수술의 종류에 따라 다릅니다) 수술 실 무 균 용기에 차가운 PBS의 교통에서 직접.
2. 무 균 조건 하에서 10 번 블레이드와 살 균 메스와 모든 지방 조직을 제거 합니다.
3. 약 1 x 1 x 1 cm의 메스를 사용 하 여 큐브에서 심근을 잘라.
4. 살 균 50 mL 튜브에 큐브를 놓습니다.
   참고: 일시 중지, 수행 단계 1.5, 그렇지 않으면 계속 단계 2.2. 단백질 저하와 조직 품질 저하를 방지 하기 위해 반복된 freeze-thaw 주기를 하지 마십시오.
5. -80 ° c.에 큐브를 포함 하는 튜브를 저장 조직 몇 달 동안 저장할 수 있습니다.

2. 조각으로 심근 큐브의 단면

1. 냉동 실에서 준비 큐브를 포함 하는 tube(s)를 가져가 라.
2. cryosta....

Results

인간의 심근의 decellularization에 대 한 3 단계 프로토콜 여기 키 ECM 구성 요소와 ECM의 원 구조를 유지 하면서 세포 소재의 가까운 완전 한 제거 결과 제시. Decellularization, 후 조직에서 세포의 총 제거 색깔 (그림 1A)에 있는 변화에 의해 분명 하다. H & E와 Masson Trichrome 얼룩으로 조직학 분석 잔여 그대로 셀 (그림 1B)의 완전 한 부재를 공개 했다. ECM의 개별 구성 요소에 대 한 양적 분석 SDS 혼자 (그림 2A)에 의해 decellularization에 비해 서 더 완전 한 DNA 제거 및 총 콜라겐, 엘라 스 틴, 및 있다의 더 나은 보존을 공개 했다. CECM의 생물 학적 활동의 기능 증거는

Discussion

다음을 달성 하는 목표는 인간의 심근 ECM를 준비할 때: 관련 된 면역성 세포 소재, ECM 무결성 및 bioactivity, 불 임, GMP 공정 호환성, 최종 제품의 비 독성의 보존의 제거 및 처리 측면에서 특정된 응용 프로그램에 대 한 제품의 적합성. 미 또는 자가 조립 히드로 처리 된 우리의 3 단계 decellularization 프로토콜을 결합 하 여 인간의 심장 ECM 소재 얻은 특정 생물 학적 활동을 보유 하 고, 처리 하 고, 쉽게에 대 한 가능성이 있다 여러 응용 프로그램에서 체 외에서 고 vivo에서, 무슨 보였다 ECM 제품에 대 한 여러 동물 종^11,13,,2021에서 비슷합니다.

심근 직물의 초.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance	DR Precisa, Dietikon, Switzerland	Precisa XR 205SM
Blades Nr.10 Skalpell Nr.3	InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany	SK-10-004
Cell culture plates (6-well)	Greiner, Frickenhausen, Germany	657160
Cryostat CM	Leica, Wetzlar, Germany	3050S
EDTA	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	8043.3
Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml)	Greiner, Frickenhausen, Germany	616201, 623201
Falcon 15ml, 50ml	Greiner, Frickenhausen, Germany	188271, 227270
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biochrome, Berlin, Germany	S 0115
Freeze Dry System	Labconco, 캔자스시티, 미국	7670520
냉동고 (-80° C)	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	Forma 900 Series
HCl	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	281.1
Microtome Blades Type 819	Leica, Wetzlar, Germany	14035838925
Minilys Homogeniser	PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany	91-PCSM
NaOH	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	K021.1
Nystatin	PAN Biotech, Aidenbach, Germany	P06-07800
PBS	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	14190-094
Penicillin/streptomycin	Life Technologies, 다름슈타트, 독일	15140122
Pepsin	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	P6887-1G
Precellys Keramik-Kit 1.4 mm	Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, 독일	91-PCS-CK14
Rotamax 120 플레이트 셰이커	Heidolph, Schwabach, Germany	544-41200-00
SDS	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	CN30.3
실체 현미경	Leica, Wetzlar, Germany	M125
Steriflip-GP, 0,22 µ m	Merck Millipore, 다름슈타트, 독일	SCGP00525
스튜어트 아날로그 로커 및 롤러 믹서	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	Z675113-1EA
Tissue Tek O.C.T compound	Hartenstein, Wurzburg, Germany	TTEK
Transfusion set 200µ m	Sarstedt, Nü mbrecht, Germany	798.200.500
TRIS	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	5429.3
vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm	Medical Highlights, Rohrdorf, Germany	CV102-003
Vortex-Genie2	Scientific Industry, New York, Germany	SI-0256