ओवेरेक्स्पेशन एंड हेरिंग ऑफ ह्यूमन<em> सीआईएस</em> -प्रेनिलट्रांसफ़्रेज़ इन<em> एस्चेरिचिया कोली</em
Summary
Overexpression और कोडोन अनुकूलित, मानव सिस -prenyltransferase की शुद्धि के लिए एक सरल प्रोटोकॉल, गैर denaturing शर्तों के तहत, Escherichia से कोली , एक एंजाइमेटिक गतिविधि परख के साथ, वर्णित है। इस प्रोटोकॉल को अन्य सीआईएस- पे्रेनिल्रांसफेरेज प्रोटीन के उत्पादन के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है, जो यांत्रिक अध्ययनों के लिए उपयुक्त मात्रा और गुणवत्ता में है।
Abstract
Prenyltransferases (पीटी) एंजाइमों का एक समूह है जो कई संक्षेपण प्रतिक्रियाओं के माध्यम से आईओपेंटेनिऑल डिफोस्फेट (आईपीपी) का उपयोग करते हुए एलिलिसीक डीफोसफेट की श्रृंखला बढ़ाव उत्प्रेरित करता है। डीएचडीडीएस (डीहाइड्रोडोलिचिल डीफोसफेट सिंथेस) एक यूकेरियोटिक लंबे-सीन सीआईएस -पीटी (संघनन प्रतिक्रिया से सीआईएस डबल बॉन्ड बनाने) है जो कि आईओपेंटेनिइल डिफोस्फेट (आईपीपी) के साथ कई संघनन के माध्यम से फेर्नसील डिफोफेट (एफपीपी, एक एलिलिसीक डीफोसफेट) की चेन बढ़ाव को उत्प्रेरित करता है। डीएचडीडीएस बायोमेडिकल महत्व का है, जैसे गैर-रूढ़िवादी उत्परिवर्तन (के 42 ई) में रेटिनाइटिस पगमेन्टोसा में एंजाइम के परिणाम, अंततः अंधापन हो जाता है। इसलिए, यांत्रिक प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए विकसित किया गया था ताकि बड़े पैमाने पर शुद्ध डीएचडीडी प्राप्त हो सके, जो यांत्रिक अध्ययनों के लिए उपयुक्त हो। यहां, प्रोटीन संलयन, अनुकूलित संस्कृति परिस्थितियों और कोडोन-अनुकूलन के उपयोग को कार्यात्मक रूप से सक्रिय मानव डीएचडीडीएस में अत्यधिक विषमता और शुद्धि की अनुमति देने के लिए उपयोग किया गया था <eमीटर> ई। कोली वर्णित प्रोटोकॉल सरल, लागत प्रभावी और समय बख्शते है। विभिन्न प्रजातियों के बीच सीआईएस- पीटी के समरूपता से पता चलता है कि इस प्रोटोकॉल को अन्य यूकेरियोटिक सीआईएस- पीटी के लिए भी लागू किया जा सकता है, जैसे प्राकृतिक रबर संश्लेषण में शामिल लोगों के रूप में।
Introduction
Prenyltransferases एंजाइमों का एक समूह है जो कई संक्षेपण प्रतिक्रियाओं 1 , 2 के माध्यम से आइसोपेंटेनिइल डिफोस्फेट (आईपीपी) का उपयोग करते हुए एलिलिसीक डीफोसफेट की श्रृंखला बढ़ाव उत्प्रेरित करता है। Z- प्रकार एंजाइम कंडेनसेशन प्रतिक्रिया से सीआईएस डबल बॉन्ड के गठन को उत्प्रेरित करते हैं, जबकि ई-टाइप एंजाइम ट्रांस डबल बांड गठन 3 उत्प्रेरित करते हैं। सीआईएस -पीनिल ट्रांस्फेरेसेस ( सीआईएस- पीटी, जेड-टाइप एंजाइम) को वर्गीकृत अपने उत्पाद श्रृंखला लंबाई के अनुसार शॉर्ट-चेन (सी 15 ), मध्यम-श्रृंखला (सी 50-55 ), और लंबी श्रृंखला (सी 70-120 4 ) डीएचडीडीएस (डीहाइड्रोडोलिचिल डिफोसफेट सिन्थेस) एक यूकेरियोटिक लंबे-सीन सीआईएस -पीटी है जो एनोपेंटेनिइल डिफोस्फेट (आईपीपी) 1 के साथ कई कंडेनसेज के माध्यम से फेर्नसील डिफोस्फेट (एफपीपी, एक एलिलिसीक डीफोहोसेट) की चेन बढ़ाव को उत्प्रेरित करता है, 5 , 6 इसका परिणाम डीहाइड्रोडोलिचिल डिफोसाइट के गठन में होता है, एक सी 55-100 पॉलीपेरेन डाइफोसाफेट, डोलिचिलप्रोफॉस्फेट के लिए अग्रदूत के रूप में सेवा कर रहा है, एन-लिंक्ड प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन 1 में शामिल ग्लाइकोसिल वाहक अणु। एश्केनाज़ी यहूदियों के बीच, डीएचडीडीएस के परिणाम में गैर-रूढ़िवादी उत्परिवर्तन (के 42 ई) के परिणामस्वरूप आटोसॉमल अपैसिव रेटिनिटिस पगमेंटोसा 7 , 8 में परिणाम होता है। इसलिए, यांत्रिक प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए विकसित किया गया था ताकि उचित डीएचडीडी को यांत्रिक अध्ययनों के लिए उपयुक्त बनाया जा सके।
Escherichia कोलाई पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए सबसे सुविधाजनक और लागत प्रभावी मेजबान माना जाता है, और इसलिए यह सबसे अधिक बार इस्तेमाल किया मेजबान है। हालांकि, जब ई। कोलाई में अतिरंजित रूप से अतिप्रभावी प्रोटीन का प्रयास करता है, प्रोटीन-विशिष्ट विचार किया जाना चाहिए। ठीक से मुड़ा हुआ, सक्रियई । कोलाई से पुनः संयोजक प्रोटीन, विभिन्न प्रोटीनों के विशिष्ट गुणों के कारण एक साधारण मामला नहीं है। इन बाधाओं पर काबू पाने के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं यहां, ई। कोलाई में कार्यात्मक रूप से सक्रिय मानव डीएचडीडीएस के अतिवृद्धि और शुद्धि की अनुमति देने के लिए प्रोटीन संलयन, अनुकूलित संस्कृति परिस्थितियों और कोडोन-अनुकूलन का उपयोग किया गया था। नोट, डिटर्जेंट 12 की उपस्थिति में भी अस्थिरता को पूरा करने के कारण प्रोटीन संलयन के बिना खमीर सीआईएस- पीटी के अति पिछड़ने की कोशिश में असफल रहा। वर्णित प्रोटोकॉल सरल, लागत प्रभावी, समय बख़्तरबंद है और एक को तंत्रिकी अध्ययन के लिए उपयुक्त DHDDS की तैयारी प्राप्त करने की अनुमति देता है। विभिन्न प्रजातियों में सीआईएस- पीटी के अनुरूपता को देखते हुए, हम सुझाव देते हैं कि इस प्रोटोकॉल को अन्य यूकेरियोटिक सीआईएस- पीटी के लिए भी लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ई। कोलाई कोशिकाओं में कार्यात्मक मानव डीएचडीडी के शुद्धिकरण के लिए यहां वर्णित प्रोटोकॉल सरल और कुशल है, एक को एक अतिरंजित करने और 3-4 दिनों में प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए उपयुक्त निर्माण उपलब्ध ह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को इजरायल साइंस फाउंडेशन के सेंटर फॉर रिसर्च एक्सलेंस (आई-कोर) स्ट्रक्चरल सेल बायोलॉजी (1775/12) में और ईसाई साइंस फाउंडेशन ने 1721/16 और 2338/16 (वाईएच), और 825/14 (डीके) को अनुदान दिया था। )। फील्ड्स एस्टेट फाउंडेशन डीके की सहायता की अत्यधिक सराहना की गई है। यह काम इलान एडीरी और माइकल गोल्डनबर्ग द्वारा किया गया था जिसमें मेकडीन के स्केकलर फैकल्टी ऑफ़ तेल अवीव विश्वविद्यालय की एमडी थीसिस आवश्यकताओं की आंशिक पूर्ति हुई थी।
Materials
| pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
| T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C3010I | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| TALON-superflow resin | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
| HiPrep 26/10 desalting column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HiLoad 16/60 superdex-200 | GE Healthcare | 28989335 | |
| superdex-200 increase 5/150 GL | GE Healthcare | 28990945 | |
| 14C-Isopentenyl pyrophosphate | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
| trans,trans-Farnesyl pyrophosphate | Sigma | 44270-10MG |
References
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