Overekspression og oprensning af mennesket<em> Cis</em> -prenyltransferase i<em> Escherichia coli</em
Summary
En simpel protokol til overekspression og oprensning af codonoptimeret human cis- phenyltransferase under ikke-denaturerende betingelser fra Escherichia Coli , er beskrevet sammen med et enzymatisk aktivitetsassay. Denne protokol kan generaliseres til fremstilling af andre cis- prenyltransferase proteiner i mængde og kvalitet egnet til mekanistiske undersøgelser.
Abstract
Prenyltransferaser (PT) er en gruppe enzymer, som katalyserer kædelængelse af allylicdiphosphat under anvendelse af isopentenyldiphosphat (IPP) via multiple kondensationsreaktioner. DHDDS (dehydrodolichyldiphosphatsyntase) er en eukaryotisk langkædede cis -PT (dannende cis- dobbeltbindinger fra kondensationsreaktionen), som katalyserer kædekonstruktion af farnesyldiphosphat (FPP, et allylicdiphosphat) via multiple kondensationer med isopentenyldiphosphat (IPP). DHDDS er af biomedicinsk betydning, da en ikke-konservativ mutation (K42E) i enzymet resulterer i retinitis pigmentosa , hvilket i sidste ende fører til blindhed. Derfor blev den nuværende protokol udviklet med henblik på at erhverve store mængder renset DHDDS, der er egnet til mekanistiske undersøgelser. Her blev brugen af proteinfusion, optimerede kulturbetingelser og codonoptimering anvendt til at tillade overekspression og oprensning af funktionelt aktive humane DHDDS i <em> E. Coli. Den beskrevne protokol er enkel, omkostningseffektiv og tidsbesparende. Homologien af cis -PT blandt forskellige arter antyder, at denne protokol kan anvendes til andre eukaryotiske cis -PT såvel som dem, der er involveret i syntetisk gummisyntese.
Introduction
Prenyltransferaser er en gruppe enzymer, der katalyserer kædeforlængelse af allylldifosfat under anvendelse af isopentenyldiphosphat (IPP) via multiple kondensationsreaktioner 1 , 2 . Z-type enzymer katalyserer dannelsen af cis- dobbeltbindinger fra kondensationsreaktionen, hvorimod E-type enzymer katalyserer trans- dobbeltbindingsdannelse 3 . cis -Prenyltransferases (cis -PT, Z-type enzymer) er klassisk klassificeres efter deres produkt kædelængde i kortkædede (C 15), medium-kæde (C 50-55), og langkædede (C 70-120 ) 4 . DHDDS (dehydrodolichyldiphosphatsyntase) er en eukaryotisk langkædede cis -PT, der katalyserer kædekonstruktion af farnesyldiphosphat (FPP, et allylldifosfat) via multiple kondensationer med isopentenyldiphosphat (IPP) 15 , 6 . Dette resulterer i dannelsen af dehydrodolichyldiphosphat, et C 55-100 polyprenyldiphosphat, der tjener som en precursor for dolichylpyrophosphat, glycosylbærermolekylet involveret i N-koblet proteinglycosylering 1 . Blandt Ashkenazi-jøder resulterer en missens ikke-konservativ mutation (K42E) i DHDDS i autosomal recessiv retinitis pigmentosa 7 , 8 . Derfor blev den nuværende protokol udviklet med henblik på at erhverve renset DHDDS egnet til mekanistiske undersøgelser.
Escherichia coli betragtes som den mest hensigtsmæssige og omkostningseffektive vært til rekombinant proteinekspression og er derfor også den hyppigst anvendte vært. Men når man forsøger at heterologt overudtrykke proteiner i E. coli , bør der laves proteinspecifikke overvejelser. Fås korrekt foldet, aktivE rekombinante proteiner fra E. coli , er ikke et simpelt spørgsmål på grund af de forskellige egenskaber af forskellige proteiner. Talrige tilgange er blevet udviklet for at overvinde disse forhindringer. Her blev brugen af proteinfusion, optimerede kulturbetingelser og codonoptimering anvendt til at tillade overekspression og oprensning af funktionelt aktive humane DHDDS i E. coli . Fremhæves, en tidligere forsøg på at overudtrykke gær cis -PT uden proteinfusion mislykkedes på grund af fuldstændig uopløselighed selv i nærvær af detergent 12. Den beskrevne protokol er enkel, omkostningseffektiv, tidsbesparende og giver en mulighed for at opnå DHDDS-præparater, der er egnede til mekanistiske undersøgelser. I betragtning af homologien af cis -PT blandt forskellige arter foreslår vi, at denne protokol også kan anvendes til anden eukaryot cis -PT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet her for rensning af funktionelle humane DHDDS i E. coli- celler er simpel og effektiv, hvilket tillader at man overudtrykker og renser proteinet i 3 – 4 dage, når en egnet konstruktion er tilgængelig. Sådanne protokoller til proteinrensning er af særlig betydning givet gennembrudene i genom-sekventering, hvilket tilvejebragte overflod af information vedrørende genetik hos mange sygdomme 18 , hvorved der kræves udvikling af høj-gennemstrømningsmetoder til kar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af Israels Videnskabsstiftelsens Center for Forskning Excellence (I-CORE) i Strukturel Cellbiologi (1775/12) og Israels Videnskabsstiftelse tildeler 1721/16 og 2338/16 (YH) og 825/14 (DK ). Støtten fra Fields Estate Foundation til DK er meget værdsat. Dette arbejde blev udført af Ilan Edri og Michal Goldenberg i delvis opfyldelse af MD-afhandlingskravene fra Sackler Fakultet for Medicin, Tel Aviv Universitet.
Materials
| pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
| T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C3010I | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| TALON-superflow resin | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
| HiPrep 26/10 desalting column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HiLoad 16/60 superdex-200 | GE Healthcare | 28989335 | |
| superdex-200 increase 5/150 GL | GE Healthcare | 28990945 | |
| 14C-Isopentenyl pyrophosphate | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
| trans,trans-Farnesyl pyrophosphate | Sigma | 44270-10MG |
References
- Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases. J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).
- Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. Polyprenyl diphosphate synthases. Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).
- Ogura, K., Koyama, T. Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation. Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).
- Imperiali, B., O’Connor, S. E. Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure. Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).
- Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis. J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).
- Adair, W. L., Cafmeyer, N. Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).
- Zelinger, L., et al. A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews. Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).
- Zuchner, S., et al. Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
- Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages. Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).
- Middelberg, A. P. Process-scale disruption of microorganisms. Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).
- Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).
- Sachyani, D., et al. Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin. Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).
- Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels. Nat Commun. 2, 457 (2011).
- Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).
- Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton. J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).
- Guo, R. T., et al. Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis. J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).
- Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. A vision for the future of genomics research. Nature. 422 (6934), 835-847 (2003).
- Freeze, H. H. Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge. J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).
- LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
- Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives. Front Microbiol. 5, 21 (2014).
- Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55 (1), 65-72 (2011).
