Sovrapressione e purificazione dell'uomo<em> Cis</em> -preniltransferasi in<emEscherichia coli</em
Summary
Un semplice protocollo di sovraespressione e di purificazione della cis -preniltransferasi umana ottimizzata dal codone, in condizioni non denaturanti, da Escherichia Coli , è stato descritto, insieme ad un test enzimatico di attività. Questo protocollo può essere generalizzato per la produzione di altre proteine di cis- preniltransferasi in quantità e qualità adatte agli studi meccanici.
Abstract
Prenyltransferasi (PT) sono un gruppo di enzimi che catalizzano l'allungamento della catena del difosfato alilico utilizzando isopentenil difosfato (IPP) attraverso reazioni di condensazione multiple. DHDDS (dehydrodolichyl difosfate synthase) è un cis -PT a lunga catena eucariotica (che forma cis doppie legame della reazione di condensazione) che catalizza l'allungamento della catena di farnesil difosfato (FPP, un difosato allilico) attraverso condensazioni multiple con isopentenil difosfato (IPP). DHDDS è di importanza biomedica, in quanto una mutazione non conservatrice (K42E) nell'enzima provoca la retinite pigmentosa , portando alla fine alla cecità. Pertanto, questo protocollo è stato sviluppato per acquisire grandi quantità di DHDDS purificate, adatte a studi meccanici. Qui, l'uso di fusione di proteine, condizioni di coltura ottimizzate e l'ottimizzazione del codone sono stati utilizzati per consentire l'eccessiva espressione e la purificazione di DHDDS umane attivamente attive in <em> E. Coli. Il protocollo descritto è semplice, conveniente e risparmio di tempo. L'omologia di cis- PT tra diverse specie suggerisce che questo protocollo possa essere applicato anche per altri cis -PT eucariotici, come quelli coinvolti nella sintesi di gomma naturale.
Introduction
Prenyltransferasi sono un gruppo di enzimi che catalizzano l'allungamento della catena del difosfato allilico usando isopentenil difosfato (IPP) attraverso reazioni di condensazione multiple 1 , 2 . Gli enzimi di tipo Z catalizzano la formazione di doppie legami cis dalla reazione di condensazione, mentre gli enzimi E-tipo catalizzano la formazione di doppio legame trans 3 . Cis -Prenyltransferases ( cis -PT, Z-type enzymes) sono classificati in modo classico in base alla loro lunghezza della catena di prodotti in catena a catena corta (C 15 ), catena media (C 50-55 ) e catena lunga (C 70-120 ) 4 . DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) è un cis -PT a lunga catena eucariotica che catalizza l'allungamento della catena di farnesil difosfato (FPP, un difosfato allilico) attraverso condensazioni multiple con isopentenil difosfato (IPP) 1, 5 , 6 . Ciò si traduce nella formazione di deidrodolicilidifosfato, un polifenilcarbossilico di C 55-100 che serve come precursore per il dolichilpirofosfato, la molecola vettore del glicosilico coinvolto nella glicosilazione della proteina N-collegata 1 . Tra gli ebrei di Ashkenazi, una mutazione non-conservativa missense (K42E) in DHDDS produce una retinite pigmentosa autosomica recessiva 7 , 8 . Pertanto, il presente protocollo è stato sviluppato per acquisire DHDDS purificati idonei per studi meccanistici.
Escherichia coli è considerato l'host più conveniente e conveniente per l'espressione di proteine ricombinanti, ed è pertanto anche l'host più utilizzato. Tuttavia, quando si tenta di esercitare eterosamente le proteine in E. coli , occorre fare considerazioni proteiche. Ottenere piegato correttamente, attivareE proteine ricombinanti da E. coli , non è una materia semplice a causa delle proprietà distinte di diverse proteine. Numerosi approcci sono stati sviluppati per superare questi ostacoli. Qui, l'uso di fusione di proteine, condizioni di coltura ottimizzate e ottimizzazione del codone sono stati utilizzati per consentire l'eccessiva espressione e la purificazione di DHDDS umane attivamente attive in E. coli . Da notare, un precedente tentativo di sovraespressione del lievito cis -PT senza fusione di proteine non è riuscito a causa della completa insolubilità anche in presenza di detersivo 12 . Il protocollo descritto è semplice, conveniente, risparmio di tempo e consente di ottenere preparati DHDDS idonei per studi meccanici. Data l'omologia del cis- PT tra diverse specie, suggeriamo che questo protocollo possa essere applicato anche per altri cis -PT eucariotici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto per la purificazione di DHDDS umane funzionali nelle cellule E. coli è semplice ed efficace, permettendo uno di sovraespressione e purificazione della proteina in 3 – 4 giorni una volta che sia disponibile un opportuno costrutto. Tali protocolli per la purificazione della proteina sono di particolare importanza data le innovazioni nel sequenziamento genomico, che hanno fornito una grande quantità di informazioni riguardanti la genetica di molte malattie 18 ,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal Centro per la Ricerca Eccellenza (I-CORE) della Fondazione Israel Science in Biologia Cellulare Strutturale (1775/12) e dalle sovvenzioni della Fondazione Israelica Science 1721/16 e 2338/16 (YH) e 825/14 (DK ). Il supporto della Fondazione Fields Estate a DK è altamente apprezzato. Questo lavoro è stato eseguito da Ilan Edri e Michal Goldenberg in parziale adempimento dei requisiti di tesi MD della Facoltà di Medicina Sackler, Università di Tel Aviv.
Materials
| pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
| T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C3010I | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| TALON-superflow resin | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
| HiPrep 26/10 desalting column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HiLoad 16/60 superdex-200 | GE Healthcare | 28989335 | |
| superdex-200 increase 5/150 GL | GE Healthcare | 28990945 | |
| 14C-Isopentenyl pyrophosphate | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
| trans,trans-Farnesyl pyrophosphate | Sigma | 44270-10MG |
References
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