Summary

인간의 과발현과 정제<em> 시스</em> - 프레 닐 트랜스퍼 라제<em> 대장균</em

Published: August 03, 2017
doi:

Summary

에스 케리 치아 (Escherichia )로부터의 비 변성 조건 하에서 코돈 최적화 된 인간 시스 – 프레 닐 전이 효소의 과발현 및 정제를위한 간단한 프로토콜 콜라이 (coli )는 효소 활성 분석과 함께 기술된다. 이 프로토콜은 기계적 연구에 적합한 양 및 품질의 다른 시스 플 닐 트랜스퍼 라제 단백질의 생산을 위해 일반화 될 수 있습니다.

Abstract

Prenyltransferases (PT)는 다중 응축 반응을 통한 isopentenyl diphosphate (IPP) 사용하여 알릴이 인산의 사슬 연신을 촉매하는 효소 군입니다. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase)는 ispenetenyl diphosphate (IPP)와의 다중 축합을 통한 farnesyl diphosphate (FPP, allylic diphosphate)의 사슬 연신을 촉매하는 진핵 장쇄 cis -PT (축합 반응으로부터 cis 이중 결합을 형성 함)이다. DHDDS는 효소의 비 보존 적 돌연변이 (K42E)가 망막염 색소 침착 으로 이어 지므로 궁극적으로 실명으로 이끄는 생물 의학적으로 중요합니다. 따라서, 본 프로토콜은 역학적 연구에 적합한 대량의 정제 된 DHDDS를 얻기 위해 개발되었다. 여기에서, 단백질 융합, 최적화 된 배양 조건 및 코돈 최적화의 사용은 기능적으로 활성 인 DHDDS의 과발현 및 정제를 허용하기 위해 사용되었다. <em> E이다. 콜리. 설명 된 프로토콜은 간단하고 비용 효율적이며 시간을 절약합니다. 상이한 종 사이의 cis -PT의 상 동성은이 프로토콜이 천연 고무 합성에 관여하는 것과 같은 다른 진핵 cis- PT에도 적용될 수 있음을 시사한다.

Introduction

Prenyltransferases 다중 축합 반응 1을 통해 아이소 펜 테닐 다이 포스페이트 (IPP)를 사용하여 알릴 포스페이트, 2 쇄 신장을 촉매하는 효소 군이다. E 형 효소 트랜스 이중 결합의 형성을 촉진하는 반면 3 Z 형 효소, 축합 반응, 시스 이중 결합의 형성을 촉매. -Prenyltransferases 시스 (시스 -PT, Z 형 효소) 고전 단 체인 (C 15), 중쇄 (C 50-55)에 자신의 제품의 사슬 길이에 따라 분류되며, 장쇄 (C 70-120 ) 4 . DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase)는 이소 펜 테닐 디 포스페이트 (IPP) 1을 이용한 다중 응축을 통해 farnesyl diphosphate (FPP, allylic diphosphate)의 사슬 신장을 촉매하는 진핵 장쇄 cis -PT입니다, 5 , 6 . 이것은 dehydrodolichyl 포스페이트의 형성을 초래하는 dolichylpyrophosphate 전구체 N – 결합 글리코 실화 단백질 1에 관련된 글리코 캐리어 분자로서의 C 55-100 polyprenyl 인산. Ashkenazi 유태인 중, DHDDS에있는 missense 비 보존 적 돌연변이 (K42E)는 염색체 열성 색소 성 망막염을 초래합니다 7 , 8 . 따라서, 본 프로토콜은 역학적 연구에 적합한 정제 된 DHDDS를 얻기 위해 개발되었다.

Escherichia coli 는 재조합 단백질 발현을위한 가장 편리하고 비용 효율적인 숙주로 여겨지며, 따라서 가장 빈번하게 사용되는 숙주이기도합니다. 그러나 대장균 에서 이종성으로 단백질을 과발현 시키려 할 때, 단백질 특유의 고려가 이루어져야한다. 적절하게 접힌 상태에서 얻음대장균 으로부터의 재조합 단백질은 상이한 단백질의 독특한 특성으로 인해 단순한 문제가 아니다. 이러한 장애물을 극복하기 위해 수많은 접근법이 개발되었습니다. 여기에서, 단백질 융합, 최적화 된 배양 조건 및 코돈 – 최적화의 사용은 대장균 에서 기능적으로 활성 인 DHDDS의 과발현 및 정제를 허용하기 위해 사용되었다. 참고로, 단백질 융합하지 않고 효모 시스의 -PT를 과발현하는 이전 시도조차 세제 (12)의 존재에 불용성을 완료 할 예정 실패했습니다. 설명 된 프로토콜은 간단하고 비용 효과적이며 시간을 절약 할 수 있으며 기계 론적 연구에 적합한 DHDDS 준비를 얻을 수 있습니다. 서로 다른 종에서 cis -PT의 상 동성을 고려할 때,이 프로토콜은 다른 진핵 cis- PT에도 적용될 수 있다고 제안한다.

Protocol

1 . E. coli 에서의 과발현을위한 cis -PT의 클로닝 109aa thioredoxin (TRX) 단백질 17 과 융합 된 단백질 서열의 클로닝 및 고수준 발현을 위해 설계된 pET-32b 발현 벡터 및 대장균 코돈 최적화 된 전장 cis -PT 18 코딩 서열을 수득한다. TEV 프로테아제 짧은가요 성 링커 하였다 (담배 식각 바이러스 단백질 분해 효소) 절단 부위 ( "…

Representative Results

여기에 사용 된 구조 및 정제 과정에 대한 일반적인 개요가 그림 1에 나와 있습니다. 각 정제 단계에서 얻은 샘플을 그림 2 에 나타냈다 . 이 SDS-PAGE 분석은 DHDDS의 단계적 정제를 보여줌으로써 매우 정제 된 제품을 생성합니다. 도 3 은 정제 된 효소의 SEC 분석 결과로서, 단백질이 동종…

Discussion

E. coli 세포에서 기능성 인간 DHDDS를 정제하기 위해 여기에 설명 된 프로토콜은 간단하고 효율적이어서 적절한 구조가 사용 가능 해지면 3-4 일 내에 단백질을 과발현하고 정제 할 수 있습니다. 단백질 정제를위한 그러한 프로토콜은 많은 질병 18 의 유전학에 관한 정보의 과다한 정보를 제공하는 게놈 시퀀싱의 돌파구를 고려할 때 특별한 의미가 있습니다. 따라서 단백질 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 이스라엘 과학 재단 재단 연구 센터 (I-CORE)의 구조 세포 생물학 (1775/12)과 이스라엘 과학 재단 보조금 (1721/16과 2338/16) (YH)과 825/14 (DK ). DK에 대한 Fields Estate Foundation의 지원은 높이 평가됩니다. 이 연구는 Ilan Edri와 Michal Goldenberg가 Tel Aviv University의 Sackler 의학부의 MD 논문 요구 사항을 부분적으로 이행함으로써 수행되었습니다.

Materials

pET-32b Novagen 69016-3
T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) NEB C3010I
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11873580001
TALON-superflow resin GE Healthcare 28-9574-99
HiPrep 26/10 desalting column  GE Healthcare 17508701
HiLoad 16/60 superdex-200  GE Healthcare 28989335
superdex-200 increase 5/150 GL  GE Healthcare 28990945
14C-Isopentenyl pyrophosphate Perkin-Elmer NEC773050UC 
trans,trans-Farnesyl pyrophosphate Sigma 44270-10MG

References

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Cite This Article
Edri, I., Goldenberg, M., Lisnyansky, M., Strulovich, R., Newman, H., Loewenstein, A., Khananshvili, D., Giladi, M., Haitin, Y. Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (126), e56430, doi:10.3791/56430 (2017).

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