Modifizierte Roller Schlauch Methode genau lokalisierte und sich wiederholende intermittierende Bildgebung während langfristige Kultur Gehirnscheiben im geschlossenen System
Summary
Hier ist eine modifizierte Roller Schlauch Methode zur Kultivierung und intermittierende hochauflösende Bildgebung des Gehirns Nagetier Scheiben über viele Wochen mit präzisen Neupositionierung auf komplexeste Deckgläsern. Neuronalen Lebensfähigkeit und Slice Morphologie sind gut gepflegt. Anwendungen dieses komplett geschlossenes System mit Viren für Zelltyp spezifische Ausdruck stehen zur Verfügung.
Abstract
Kultivierte Nagetier Gehirnscheiben eignen sich für die Erforschung der zellulären und molekularen Verhaltens der Neuronen und Glia in einer Umgebung, die viele ihrer normalen in-Vivo -Interaktionen unterhält. Scheiben aus unterschiedlichsten transgene Mauslinien oder Verwendung von viralen Vektoren für Ausdruck von Eindringmittel tagged Proteinen oder Reporter in Wildtyp Gehirnscheiben gewonnen ermöglichen hochauflösende Bildgebung durch Fluoreszenz-Mikroskopie. Obwohl verschiedene Methoden entwickelt worden sind, für imaging Gehirnscheiben kombiniert Stück Kultur mit der Fähigkeit zu führen hat sich wiederholende hochauflösende Bildgebung bestimmter Zellen in live Scheiben über längere Zeit Probleme aufgeworfen. Dies gilt insbesondere, wenn virale Vektoren für Expression exogene Proteine verwendet werden, da dies am besten geschieht in einem geschlossenen System zum Schutz der Nutzer und Kreuzkontamination zu verhindern. Einfache Änderungen an der Walze Rohr Gehirn Stück Kultur-Methode, die für sich wiederholende hochauflösende Bildgebung von Scheiben über viele Wochen in einem geschlossenen System zu ermöglichen, werden gemeldet. Kultivierung der Scheiben auf komplexeste Deckgläsern erlaubt die Verwendung von treuhändische Markierungen schnell und genau die Bühne, um das gleiche Feld im Laufe der Zeit vor und nach verschiedenen Behandlungen Bild neu positionieren. Beispiele sind für den Einsatz dieser Methode kombiniert mit spezifischen neuronalen Färbung und Ausdruck, Änderungen in der hippocampal Stück Architektur zu beobachten, viral-vermittelte neuronale Ausdruck von fluoreszierenden Proteinen und die Entwicklung von Cofilin Pathologie dargestellt, die zuvor im Hippocampus der Alzheimer-Krankheit (AD) in Reaktion auf die Scheibe Behandlung mit Oligomere von Amyloid-β (Aβ) Peptid beobachtet wurde.
Introduction
Primärkultur dissoziierten Neuronen aus Regionen des Gehirns Nagetier ist, ein wichtiges Instrument, die von den Forschern verwendet, um Antworten auf pathologisch beobachten reizen beteiligt. Solche Studien haben jedoch den Nachteil Neuronen nur 2D und ohne ihre Glia Support-System zu betrachten. Darüber hinaus unmöglich, es sei denn unter Bedingungen mit sehr hoher Dichte (640 Neuronen/mm2 oder etwa 16 % der Fläche) in dem sie angebaut, zufällige Auswuchs von einem Dendriten und Axon für mehr als eine kurze Strecke von den Zellkörper, hippocampal folgen neuronalen Lebensfähigkeit sinkt über 4 Wochen deutlich1, Begrenzung der Verwendung von dissoziierten Kulturen für erweiterte Studien von altersbedingten Krankheiten. Die Kultivierung von Scheiben aus Nagetier Gehirn vorbereitet, ist eine attraktive Option, die diese Grenzen überwindet durch die Aufrechterhaltung einer organisierten Zellarchitektur und Lebensfähigkeit für Wochen oder Monate. Bedingungen für die Aufrechterhaltung von vielen verschiedener Regionen Nagetier Gehirn im Stück Kultur wurden beschrieben2.
Zwei wichtige Methoden sind am meisten benutzt für langfristige Kultur Gehirnscheiben: Kultivierung auf Membranen in der Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle3 oder Kultivierung auf Deckgläsern in versiegelten Röhren um in einem Roller-Inkubator Belüftung4zu drehen durfte. Scheiben-kultivierte auf Membranen können direkt mit hochauflösender Fluoreszenz-Mikroskopie mit einem aufrechten Mikroskop und Wasser eintauchen Ziele5abgebildet. Alternativ wurden Scheiben kultiviert auf Membranen in Glasschalen unten gute Auflösung von dendritischen Dornen mit einer inversen Mikroskop6erreicht übertragen. Jedoch sind beide Methoden von imaging-Scheiben auf Membranen angebaut offene Systeme, die mittlere Änderungen erfordern und oft Antimykotika und/oder Antibiotika zur Verhinderung oder Reduzierung der Verschmutzung5,6. Scheiben auf einer Membran an der Luft-Medium-Schnittstelle pflegen ausgezeichnete Morphologie und überleben, aber Rückkehr zur genauen Standorte während der sich wiederholenden Bildgebung bei hoher Vergrößerung ist extrem schwierig, es sei denn, das Experiment nur kleine Gruppen von Zellen folgt mit dem Ausdruck eines fluoreszierenden Markers. Obwohl Scheiben gewachsen auf Membranen mit viral-vermittelten Expression von transgenen5,6 verwendet wurden, können biologische Sicherheit Protokolle erfordern eine geschlossene Kultursystem eingesetzt werden, für bestimmte virale Vektoren, die für verwendet werden mit dem Ausdruck Eindringmittel getaggt Proteine und Reporter der Zellphysiologie. Darüber hinaus erfordern eintauchen Ziele Dekontamination zwischen Proben, die in Kultur5folgen werden. Eine wichtige Anwendung der Membran Schnittstelle Kulturen verbindet hochauflösende Bildgebung mit Elektrophysiologie bei Mal Punkte7.
Die Walze Rohr Methode mit Deckgläsern in das Kunststoffrohr lässt keine Elektrophysiologie oder hochauflösende Bildgebung ohne das Deckglas. So wurde diese Methode in den meisten Fällen zu Langzeitstudien angewendet in der Post-Fixierung Beobachtungen8vorgenommen wurden. Hier beschrieben, ist eine Methode, die nutzt die Walze Rohr Kultur Technik aber auf gebohrt-Out Röhren mit Scheiben auf Deckgläsern, die wiederholt können, so lange wie die Kulturen abgebildet werden sind gepflegt. Das geschlossene System erfordert keine mittlere Änderung für die Bildgebung und nutzt komplexeste Deckgläsern treuhändische Marken bieten, die es ermöglichen, imaging bei hoher Vergrößerung, nach Tagen oder Wochen, die präzise Felder vorher abgebildet.
Wir wenden diese Methode, um Änderungen im Nagetier Hippocampus, einer wichtigen Hirnregion beteiligt, Gedächtnis und lernen zu untersuchen. Nagetiere-Hippocampus ist oft untersucht, als Modell für pathologische oder altersbedingten Veränderungen, die während der Entwicklung der kognitiven Beeinträchtigung9, wie n. Chr. auftreten beobachtet. Unsere Methode eignet sich besonders gut für pathologische Veränderungen zu studieren, die innerhalb einer einzigen Scheibe zu im Laufe der Zeit als Reaktion auf Veränderungen der Umwelt, wie z. B. Anstieg der Aβ-Peptide entwickeln, die ist charakteristisch für AD8. Eine Pathologie mit menschlichen und Nagetier AD Gehirn verbunden ist das Vorhandensein von Cofilin-Aktin-Aggregate und Stangen, die letztere mit Bündel von Fäden in denen Cofilin und Aktin sind in einem 1:1 Molverhältnis10,11, 12. Stäbe in festen Scheiben des Ratte Hippocampus nach Aβ-Behandlung, sowie in eine live Nagetier Gehirn-Scheibe mit dem Ausdruck Cofilin-GFP Hypoxie8ausgesetzt eingehalten worden, und sie können zu der synaptischen Dysfunktion gesehen in AD und Schlaganfall. Hier verwenden wir diese neue Methode der Kultivierung der zeitlichen Verlauf und Verteilung in Scheiben zum Ausdruck gebrachten exogene Chimären fluoreszierende Proteine durch verschiedene Viren eingeführt. Wir nutzen dann die neuronale Konkretisierung von Cofilin Reporter Konstrukt, die Entwicklung von Cofilin Stab und aggregierte Pathologie in hippocampal Scheiben in Reaktion auf die Behandlung mit löslichen Aβ Oligomere (Aβo) verfolgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene Methode der Walze-Röhre ermöglicht langfristige Kultivierung und hochauflösende live Imaging von geschnittenen Hirngewebe. Ein großes Problem mit der Slice-Technik wie hier ist bei der Montage und Wartung von Scheiben. Deckglas Beschichtungen, die Slice-Adhäsion, unterstützen fördern Slice Ausdünnung durch die Stärkung der Auswuchs Neuriten und Wanderung von Zellen aus der Scheibe; wir vermieden die Verwendung dieser Substrate. Das Einfügen von Aminogruppen auf das Glas durch Behandlung mi…
Materials
| Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
| Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
| Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
| Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
| Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
| Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
| Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
| Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
| Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
| Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
| Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
| Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
| Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
| Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
| Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
| 6 mm hole punch | Office Max | ||
| 12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
| 70% Ethanol | |||
| Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
| Bunsen Burner | |||
| Absolute Ethanol | |||
| Nanopure Water | |||
| 3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
| Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
| Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| #21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
| Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Thrombin, Bovine | Fisher | 60-516-01KU | 150 units /ml in GBSS/Glucose, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
| Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
| N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
| Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
| Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
| 159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
| Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
| Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
| Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
| Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
| Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
| Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
| Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
| Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
| Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
References
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