密閉システムで脳スライスの長期培養中に正確にローカライズされた、反復的な断続的なイメージングのため変更されたロール チューブ法
Summary
提示し、培養するため変更されたロール チューブ法をここでは、フォトエッチング coverslips に再配置する正確に何週間もかけてスライスの齧歯動物の脳の断続的な高分解能イメージング。神経細胞の生存とスライス形態も維持されます。細胞型特異的発現ウイルスを用いたこの完全に囲まれたシステムのアプリケーションを提供しています。
Abstract
培養齧歯類脳スライスは、ニューロンとグリア通常体内の相互作用の多くを保持する環境での細胞および分子の挙動を調べる場合に役立ちます。蛍光顕微鏡による高分解能イメージングのためさまざまなトランスジェニック マウス線または蛍光付けられた蛋白質または野生型脳スライスのレポーターの発現ウイルスベクターの使用から得られたスライスを許可します。イメージング脳スライス、スライス培養を組み合わせて実行する機能のいくつかの方法が開発されているが、長時間にわたりライブ スライスの特定のセルの繰り返しの高分解能イメージングは、問題を提起しています。最高ユーザーを保護し、交差汚染を防ぐためにクローズド システムで行われるため外因性タンパク質の発現ウイルスベクターを使用、これは特に当てはまります。密閉システムで何週間もかけてスライスの繰り返しの高分解能イメージングを可能にするローラー管脳スライス培養法は、単純な変更が報告されます。フォトエッチング coverslips にスライスを養殖を迅速かつ正確には、さまざまな治療法の前後に時間をかけて同じフィールドをイメージするステージを再配置する基準マークの使用できます。特定の神経細胞の染色し海馬スライスのアーキテクチャの変化を観察するための式、蛍光蛋白質のウイルスによる神経発現とコフィリン病理学の発展と組み合わせてこのメソッドの使用方法の例が表示されます。アルツハイマー病 (AD) の海馬におけるアミロイド β (a β) ペプチドのオリゴマーをスライス処理に応答, 以前。
Introduction
齧歯動物の頭脳の地域から解離細胞の初代培養はレスポンスを病理組織学的に観察する研究者によって使用される重要なツールに刺激が関与しています。ただし、このような研究は、ニューロンだけ 2 D で、グリア サポート システムを見ての欠点を持っています。さらに、それの非常に高密度化 (640 ニューロン/mm2または表面積の約 16%) の条件下で栽培しない限りなります短い距離以上の海馬はその細胞体から樹状突起や軸索のランダムな副産物を従うことができません。神経細胞生存率 4 週間以上1、加齢に伴う病態の拡張研究解離文化の使用を制限する著しく低下しました。齧歯動物の脳から調製したスライスの養殖は、数週間または数か月の組織細胞と生存率を維持することでこれらの制限を克服する魅力的なオプションです。スライス培養における齧歯動物の脳の多くの異なる領域を維持するための条件は、説明2をされています。
2 つの主要な方法は広く使用される長期培養脳スライス:3の気液界面膜を培養または密封された管内 coverslips に培養通気4を提供するためにローラーのインキュベーターで回転できます。膜上で培養したスライスの正立顕微鏡と水浸漬目標5を使用して高解像度蛍光顕微鏡による直接イメージを作成できます。また、膜上で培養したスライスは、倒立顕微鏡6を使用して樹状突起スパインの良好な分解能を達成するためにガラス底培養皿に転送されています。ただし、膜上に成長したスライスを画像の両方の方法は媒体の変更を必要とし、多くの場合抗真菌剤や抗生物質を使用して回避または低減汚染5,6オープン ・ システムです。優れた形態や生存率、空気中の界面膜上のスライスを維持が高倍率で反復的なイメージ投射の間の正確な位置に戻るは非常に難しい実験は細胞の唯一の小さなグループに続く蛍光マーカーを表現します。膜上に成長したスライスは、ウイルスによる発現遺伝子5,6で使用されている、バイオ セーフティ プロトコル必要がありますに使用される特定のウイルスのベクトルに囲まれた文化システムが採用されます。蛍光を表現するタグ付きのタンパク質や細胞生理学記者。さらに、浸漬の目的は文化5に続いて、サンプル間の除染を必要とします。膜インターフェイス文化の 1 つの主要なアプリケーションは、単一の時間ポイント7で電気生理学と高分解能イメージングを組み合わせることです。
プラスチック製のチューブ内 coverslips にロール チューブ法、coverslip を削除せず電気生理学または高分解能イメージングを許可しません。したがって、このメソッドは、最も頻繁に8のポスト固定観測が実施された長期的な研究に適用されています。ここで説明した、ローラー チューブ培養技術を利用して、文化として長い間繰り返しイメージを作成することができます coverslips にスライスと掘削を管に維持される方法です。囲まれたシステムは、イメージングの中型の変更を必要としないと、フォトエッチング coverslips イメージング高倍率、数日または数週間後で以前のイメージを作成する正確なフィールド許可基準マークを提供するために利用します。
齧歯動物の海馬は、記憶と学習に関与する主要な脳の領域に変更を検討する本手法に適用します。齧歯動物の海馬は、認知障害9広告で発生したなどの開発中に病理組織学的、または加齢に伴う変化のためのモデルとしてよく勉強しました。本手法は特に広告8の特徴である a β ペプチドの増加などの環境の変化に対応で時間をかけて 1 つのスライス内で開発の病理学的変化の研究に適しています.コフィリン アクチン凝集体の存在である人間と齧歯動物の AD 脳に関連付けられている 1 つの病理学、ロッド、コフィリンとアクチン フィラメントの後者含まれているバンドルは、1:1 モル比10、11,12. ロッド固定スライス a β 投与ラット海馬だけでなく、コフィリン gfp 低酸素8を受けるライブ齧歯動物脳スライス内で観察されているし、広告に見られるシナプスの機能不全に貢献するかもしれないストローク。ここで我々 は時間コースと別のウイルスによって導入された表現された外因性キメラ蛍光蛋白質のスライス内の分布を観察するのにこの新しい培養方法を使用します。コフィリン ロッドと海馬スライスにおける可溶性 a β オリゴマー (a βo) による治療への応答の集計の病理学の発展に従ってくださいコフィリン記者構造、神経特異的発現し利用します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明したロール チューブ法は、長期培養とスライスした脳組織の高解像度のライブ イメージングします。ここで適用されるのスライス技術で一つの大きな問題は、取り付けとスライスのメンテナンスです。スライス接着をサポート Coverslip コーティング促進神経突起の伸長と細胞のスライスからの移動を高めることによってスライスが薄くなります。したがって、我々 はこれらの基?…
Materials
| Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
| Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
| Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
| Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
| Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
| Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
| Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
| Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
| Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
| Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
| Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
| Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
| Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
| Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
| Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
| 6 mm hole punch | Office Max | ||
| 12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
| 70% Ethanol | |||
| Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
| Bunsen Burner | |||
| Absolute Ethanol | |||
| Nanopure Water | |||
| 3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
| Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
| Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| #21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
| Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Thrombin, Bovine | Fisher | 60-516-01KU | 150 units /ml in GBSS/Glucose, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
| Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
| N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
| Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
| Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
| 159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
| Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
| Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
| Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
| Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
| Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
| Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
| Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
| Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
| Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
References
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. 신경과학. 305, 86-98 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).
- Roo, M. D., Ribic, A. Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture. Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).
- Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -. P., Béīque, J. -. C. Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development. Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).
- Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods. J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).
- Clark, R. E., Squire, L. R. Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10365-10370 (2013).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).
- Rahman, T., et al. Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).
- He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).
- Minamide, L. S., et al. Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons. Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).
- Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).
- Mi, J., et al. A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons. PLOS ONE. 8 (12), 83609 (2013).
- Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. Production and purification of recombinant adeno-associated vectors. Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).
- Matsushita, T., et al. Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).
- Ward, P., Walsh, C. E. Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region. Virology. 433 (2), 356-366 (2012).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLOS ONE. 6 (4), 18556 (2011).
- Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Lentivirus production and purification. Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).
- Huang, L., Chen, C. Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells. AIDS Res Ther. 7, 27 (2010).
- Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg. Virol J. 12, 89 (2015).
- Er, J. C., et al. NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).
- Cichon, J., et al. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).
- Stine, W. B., Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).
- Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer’s disease. J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).
- Davis, R. C., et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation. Mol Neurodegener. 6, 10 (2011).
- Walsh, K. P., et al. Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons. PLOS ONE. 9 (4), 95995 (2014).
- Woo, J. A., et al. RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction. Cell Death Disease. , 6 (2015).
- Shaw, A. E., Bamburg, J. R. Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders. Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).
