Modifisert Roller Tube metode for nettopp lokaliserte og repeterende intermitterende Imaging under langsiktige kultur på hjernen sektorer i et lukket System
Summary
Her er en modifisert valse røret metode for dyrking og intermitterende høyoppløselig avbilding av gnager hjernen skiver over mange uker med presis reposisjonering på photoetched coverslips. Neuronal levedyktighet og skive morfologi er godt vedlikeholdt. Anvendelser av innelukket systemet bruker virus for celle-type spesifikke uttrykk er gitt.
Abstract
Kultivert gnager hjernen stykker er nyttig for studerer cellulære og molekylære virkemåten til neurons og glia i et miljø som opprettholder mange av deres normale i vivo interaksjon. Skiver fra en rekke transgene musen linjer eller bruk av viral vektorer for uttrykk for fluorescently merket proteiner eller journalister i vill type hjernen skiver kan høy-resolution tenkelig ved fluorescens mikroskopi. Selv om flere metoder har blitt utviklet for imaging hjernen skiver, kombinerer skive kultur muligheten til å utføre utgjort repeterende høyoppløselige bilder i bestemte celler i levende skiver over lange tidsperioder problemer. Dette gjelder spesielt når viral vektorer brukes for uttrykk for eksogene proteiner siden dette er best gjort i et lukket system å beskytte brukerne og forhindre. Enkle endringer som er gjort til valse røret hjernen stykke kultur metoden, og at ved repeterende høyoppløselig avbildning av skiver over mange uker i et lukket system rapporteres. Dyrking skiver på photoetched coverslips tillater bruk av fiducial merker raskt og presist flytte scenen å bildet feltet identiske over tid før og etter ulike behandlinger. Eksempler vises for bruk av denne metoden kombinert med spesifikk neuronal farging og uttrykk for å observere endringer i hippocampus stykke arkitektur, viral-mediert neuronal uttrykk for fluorescerende proteiner og utvikling av cofilin patologi, som ble tidligere observert prefiks av Alzheimers sykdom (AD) skive behandling med oligomers av amyloid-β (Aβ) peptid som svar.
Introduction
Primære kultur dissosiert neurons fra regioner av gnager hjernen er et viktig verktøy brukes av forskere til å observere Svar å pathologically innblandet stimuli. Men har slike studier ulempen ved å se på nerveceller i bare 2D og uten deres glial støttesystem. Videre med mindre vokst under forhold med svært høy tetthet (640 neurons/mm2 eller ca 16% av arealet) der det blir umulig å følge tilfeldig resultatet av en dendrite eller axon for mer enn en kort avstand fra celle kroppen, hippocampus neuronal levedyktighet synker over 4 uker betydelig1, begrenser bruken av dissosiert kulturer for utvidede studier av alder-relaterte sykdommer. Dyrking av skiver forberedt fra gnager hjernen er et attraktivt alternativ som overvinner disse begrensningene ved å vedlikeholde en organisert celle arkitektur og levedyktigheten for uker eller måneder. For å opprettholde mange regioner av gnager hjernen i skive kultur har vært beskrevet2.
To store metoder brukes for langsiktig kultur av hjernen skiver: dyrking på membraner på luft-flytende grensesnitt3 eller dyrking på coverslips i forseglet rør kan rotere en valse inkubator å gi lufting4. Skiver kultivert på membraner kan avbildes direkte med høy oppløsning fluorescens mikroskopi bruke oppreist mikroskop og vann nedsenking mål5. Alternativt har skiver kultivert på membraner blitt overført til glass bunn retter å oppnå god oppløsning av dendrittiske spines bruker en invertert mikroskop6. Begge metodene Imaging skiver dyrket på membraner er imidlertid åpne systemer som krever middels endringer og bruker ofte soppdrepende og/eller antibiotika for å forhindre eller redusere forurensning5,6. Skiver på en membran i luften mellomstore grensesnittet opprettholde gode morfologi og overlevelse, men tilbake til nøyaktige under repeterende bildebehandling på forstørring er svært vanskelig med mindre eksperimentet følger bare små grupper av celler uttrykke merketråd fluorescerende. Selv om skiver dyrket på membraner har blitt brukt med viral-mediert uttrykk effekter av transgener5,6, kan biosafety protokoller kreve en lukket kultur-systemet benyttes for visse viral vektorer som brukes for uttrykke fluorescently merket proteiner og journalister av cellen fysiologi. Videre krever nedsenking mål dekontaminering mellom eksempler som skal følges i kultur5. En stor anvendelse av membran grensesnitt kulturer er å kombinere høy oppløsning bildebehandling med elektrofysiologi på gang poeng7.
Metoden valse røret med coverslips inne i plast røret tillater ikke noen elektrofysiologi eller høy-resolution tenkelig uten å fjerne dekkglassvæske. Dermed er denne metoden oftest brukt til langsiktige studier der etter fiksering observasjoner er gjort8. Beskrevet her er en metode som utnytter valse røret kultur teknikken, men på boret ut rør med skiver på coverslips som kan avbildes gjentagelser så lenge kulturer opprettholdes. Lukkede systemet krever ingen medium endring for bildebehandling og utnytter photoetched coverslips for å gi fiducial merker at imaging på forstørring, etter dager eller uker, presis feltene tidligere fotografert.
Vi bruker denne metoden for å undersøke endringer gnager prefiks, en stor hjerne region involvert inne hukommelse og læring. Gnager hippocampus er ofte studert som en modell for patologisk eller alder-relaterte endringer observert under utviklingen av kognitiv svekkelse9, for eksempel de som oppstår i Annonsen. Vår metode er spesielt godt egnet til å studere patologiske forandringer som utvikler i et enkelt stykke over tid som respons til endringer i miljøet, slik som økning i Aβ-peptider som er karakteristisk for AD8. En patologi forbundet med menneskelige og gnager AD hjernen er tilstedeværelsen av cofilin-utgangen aggregater og stenger, sistnevnte som inneholder bunter av filamenter som cofilin og utgangen er i en 1:1 molar forholdet10,11, 12. stenger har blitt observert i fast skiver av rotte hippocampus etter Aβ behandling, samt i en levende gnagere hjerne skive uttrykke cofilin-GFP utsatt for hypoksi8, og de kan bidra til at synaptic dysfunksjon i AD og slag. Her bruker vi denne nye culturing metoden for å observere den gang forløp og distribusjon i skiver av uttrykt eksogene chimeric fluorescerende proteiner introdusert av forskjellige virus. Vi deretter bruke neuronal bestemte uttrykk for en cofilin reporter konstruere å følge utviklingen av cofilin stang og samlet patologi i hippocampus skiver i respons på behandling med løselig Aβ oligomers (Aβo).
Protocol
Representative Results
Discussion
Valse røret metoden beskrevet her gir langsiktig dyrking og høy oppløsning live bildebehandling av skiver hjernevev. En viktig sak med SKIVE teknikken som brukes her er i montering og vedlikehold av skiver. Dekkglassvæske belegg som støtter skive vedheft, fremme skive tynning ved å forbedre resultatet av neurites og migrering av celler av stykket; dermed unngikk vi bruk av disse underlag. Innsetting av amino grupper på glasset av behandling med 3-aminopropyltriethoxysilane bedre etterlevelse av skiver, men for lit…
Materials
| Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
| Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
| Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
| Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
| Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
| Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
| Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
| Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
| Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
| Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
| Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
| Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
| Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
| Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
| Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
| 6 mm hole punch | Office Max | ||
| 12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
| 70% Ethanol | |||
| Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
| Bunsen Burner | |||
| Absolute Ethanol | |||
| Nanopure Water | |||
| 3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
| Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
| Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| #21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
| Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Thrombin, Bovine | Fisher | 60-516-01KU | 150 units /ml in GBSS/Glucose, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
| Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
| N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
| Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
| Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
| 159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
| Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
| Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
| Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
| Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
| Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
| Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
| Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
| Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
| Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
References
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. 신경과학. 305, 86-98 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).
- Roo, M. D., Ribic, A. Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture. Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).
- Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -. P., Béīque, J. -. C. Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development. Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).
- Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods. J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).
- Clark, R. E., Squire, L. R. Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10365-10370 (2013).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).
- Rahman, T., et al. Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).
- He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).
- Minamide, L. S., et al. Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons. Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).
- Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).
- Mi, J., et al. A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons. PLOS ONE. 8 (12), 83609 (2013).
- Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. Production and purification of recombinant adeno-associated vectors. Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).
- Matsushita, T., et al. Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).
- Ward, P., Walsh, C. E. Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region. Virology. 433 (2), 356-366 (2012).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLOS ONE. 6 (4), 18556 (2011).
- Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Lentivirus production and purification. Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).
- Huang, L., Chen, C. Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells. AIDS Res Ther. 7, 27 (2010).
- Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg. Virol J. 12, 89 (2015).
- Er, J. C., et al. NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).
- Cichon, J., et al. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).
- Stine, W. B., Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).
- Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer’s disease. J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).
- Davis, R. C., et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation. Mol Neurodegener. 6, 10 (2011).
- Walsh, K. P., et al. Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons. PLOS ONE. 9 (4), 95995 (2014).
- Woo, J. A., et al. RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction. Cell Death Disease. , 6 (2015).
- Shaw, A. E., Bamburg, J. R. Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders. Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).
