Denne protokollen beskriver kvantifisering av flere cytokin mål samtidig i vev kultur supernatants fra stimulert musen splenocytes multiplex perle basert immunanalyse plattform og en flyt cytometer.
Perle-baserte immunanalyser benytter samme grunnleggende prinsipp som sandwich immunanalyser. Fange perler, som kan differensieres etter størrelse og interne allophycocyanin (APC) fluorescens intensitet, er konjugert til antistoffer spesifikke for en bestemt analytt. Deretter er et valgte panel av definerte opptakssett perle ruges med et biologiske utvalg som inneholder målet analytter gjelder for fangst antistoffer. Et biotinylated gjenkjenning antistoff cocktail legges, som fører til dannelsen av fange perle-analytt-gjenkjenning antistoff smørbrød.
Endelig legges streptavidin-phycoerythrin (SA-PE), som binder seg til biotinylated oppdagelse antistoffer, gir fluorescerende signal intensiteter forhold til hvor mye bundet analytt. PE fluorescerende signal analytt-spesifikke perler regioner er kvantifisert ved hjelp av flowcytometri og konsentrasjonen av bestemt analytter fastsettes ved hjelp av dataanalyse programvare og standardkurven generert i analysen.
I dette eksperimentet bruker vi en mus T helper cytokin panel samtidig kvantifisere konsentrasjonen av 13 separate cytokin mål i vev kultur supernatants fra mus splenocytes kulturperler under ulike stimulerende forhold.
I sin rolle som løselig signalnettverk molekyler formidle cytokiner svært koordinert og multifaktoriell prosessene som styrer vert immunologiske svar. De er uttrykt i alle faser av inflammatoriske prosessen, fra innvielsen oppløsning, og regulere et komplekst samspill nettverk som bruker egne syntese og til deres cellular reseptorer1. Denne kommunikasjonsnettverk er lagdelt med en kompleksitet som går utover synergistisk eller antagonistiske forholdet som eksisterer mellom komponentene. Faktisk er mange cytokiner kjent for å dele overflødige eller minst delvis overlappende2,3.
Integrerte systemer biologi tilnærminger som samtidig kvantifisere flere cytokin analytter er å tilby en stadig mer omfattende forståelse av den unike cytokinomes som arrangerer immunreaksjoner underliggende flere sykdom sier4,5. Disse sykdom stater varierer fra generalisert betennelse cancer, Nevro-degenerative tilstander og hjerte-og karsykdommer6,7,8,9.
Slike cytokin nettverk kan bli avhørt effektivt bruke LEGENDplex perle-baserte immunanalyser. Disse analyser er basert på samme prinsipp som sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent analysen (ELISA), og bruke fluorescens kodet mikrosfærer med fangst antistoffer covalently knyttet til deres overflate. Disse antistoffene er immobilisert på flater mye mindre enn de som kreves av tradisjonelle ELISA formater. Dette gjør at slike analyser utføres med langt mindre utvalg volum, mens samtidig redusere uspesifisert bindende og gir multiplekset analyse av flere analytter.
Analysen beskrevet i denne protokollen utnytter denne teknologien å quantitate opp til 13 mål samtidig. Data fra denne analysen kan oppnås ved hjelp av en rekke lett tilgjengelige flyt cytometers og i motsetning til andre tilgjengelige analyser krever ikke bruk av dedikert analysen-spesifikke instrumentering. Med en voksende katalog av validerte analytt paneler, har disse analyser blitt brukt i flere pågående biomedisinsk forskning prosjekter10,11,12,13.
For å demonstrere den enkle og nytte av analysen format, i dette eksperimentet vi bruke en mus T helper cytokin panel for å quantitate skille 13 cytokin konsentrasjoner fra vev kultur supernatants fra mus splenocytes kultivert under flere stimulerende forhold. I tillegg til vev kultur supernatants, kan denne analysen også utføres serum- eller utvalg.
8. Videre til dataanalyse Merk: The FCS filer generert på flyt cytometer bør analyseres ved hjelp av dataanalyse programvare, hvilke kan dataoverførte gratis 14. Installere data analyseprogramvare på en PC. Overføre alle analysen FCS-filer til datamaskinen som inneholder analyseprogramvare. Kobler lisens nøkkel dongle (inkludert i pakken) til en USB-port på datamaskinen. Starte data analyseprogramvare. Klikk på blå " Legg til filer " knappen øverst på skjermen. Naviger til mappen som inneholder FCS filene fra analysen i popup-vinduet som vises. Klikk og dra alle analysen FCS filer fra popup-vinduet til displayet programvare. Alle filene skal nå vises i en liste. Klikk grønne " neste " knappen på nederst til høyre på skjermen. Venstre-klikk og hold for å dra lille blå standardkurve knapper (C7 til C0) til tilsvarende FCS filer fra listen for å definere standardkurven. Klikk grønne " neste " knappen på nederst til høyre på displayet for å åpne gating pop opp vinduet. På venstre side av vinduet gating angi navnene på begge A og B perle regioner analysen analytt mål og deres tilknyttede perle-IDen (finnes i håndboken som fulgte med analysen) i stigende rekkefølge. Velg gating fra toppen av popup-vinduet og bruke den til å tegne 2 porter i FSC vs SSC tomten, en rundt A perler og andre rundt B perlene. Gjennom APC vs PE scatter tomter som vises under FSC vs SSC tomten som vises. Det vil være 6 analytt band i A perler (venstre tomt) og 7 analytt band i B perler (høyre plott). Merk: Gates kan tilbaketrekkes manuelt ved å velge viskelæret på toppen og klikke for å slette en bestemt gate. Verktøyet gating kan deretter valgt og brukt til å bruke en port manuelt regionen ønskede båndet. Klikk grønne " OK " knappen Lukk gating popup-vinduet og gå tilbake til listen over FCS filer. Definerer alle fortynninger som ble gjort biologiske prøver av rett klikker en gitt fil, velge " fortynning brett " fra menyen og inn den riktige verdien. Klikk grønne " kjøre "-knappen nederst til høyre på displayet for å utvikle standard kurvene for analysen og Beregn konsentrasjonen av ukjent biologiske prøver.
Analysen formatet beskrevet i denne protokollen gir robust kvantifisering løselig megler profiler i biologiske prøver gitt eksperimentator har god laboratorium teknikk og overholder de anbefalte protokollen.
Det er flere viktige trinn som må følges for å garantere pålitelige resultater. Først må rekombinant standarder tillates å gjeninnføre i analysebuffer heltid anbefales, og etter bare fortynnet i polypropylen rør. Polystyren rør kan fremme overholdelse av proteiner til veggen av rørene, som kan føre til lav signaler ved generering av standardkurven. Andre, riktig riste under inkubasjon trinnene er avgjørende. Uten riktig agitasjon, kan bindende egenskaper analysen perlene bli alvorlig hindret. I tillegg er riktig vask mellom inkubasjon trinn også nødvendig. Eksperimentator må sikre at overflødig reagenser er fjernet fra brønnene før du setter i neste trinn i protokollen. Instrumenter innstillinger for flyt cytometer brukes til å forhøre analysen perler må optimaliseres også. Spesielt må avdrag innstillinger justeres for å sikre riktig perle separasjon og brede dynamiske områder for standard kurvene. Til slutt, like før blir analysert på cytometer, perler må være vortexed å sikre riktig suspensjon og unngå dannelse av aggregater som kan forskyve resultatene.
Denne protokollen kan potensielt endres for å analysere vev homogenates samt hvilke eksempel diskutert i dette manuskriptet forutsatt forskeren er villig til å optimalisere sine lyse protokollen før du utfører stort, full plate analyser. Er selve teknikken vil selvfølgelig varierer avhengig av vev; men bør generelt protokollen bruke en nøytral pH buffer inneholder fysiologiske konsentrasjoner av ioniske salter, ingen denaturing kjemikalier og fortrinnsvis uten vaskemidler. Hvis vaskemiddel må brukes, bør ikke-ioniske vaskemiddel konsentrasjoner holdes på et minimum (f.eks mer enn 1%). Bufferen bør også inneholde tilstrekkelig proteasehemmere for å hindre proteolytisk nedbrytning av målet proteiner. Uansett lysis protokollen brukes, bør de siste forberedelsene være sentrifugeres for å fjerne partikler før analyse.
Om analysen begrensninger, konsentrasjonen av analytt mål i biologiske utvalg typer kan variere sterkt. For å kvantifisere analytt konsentrasjoner, må de være innenfor de øverste og nederste verdiene for standardkurven. Ekstrapolering av verdiene i kurven er ikke nødvendigvis være pålitelige og anbefale ikke. Etterforskerne må derfor optimalisere fortynninger av sine bestemt prøver i piloten eksperimenter før du kjører en full plate analysen. Dessuten er forsiktig utarbeidelsen av de biologiske prøvene å være assayed viktig for suksessen til denne analysen format. Eksempler som er lipemic, hemolyzed, eller inneholder protein rusk vil påvirke antigen antistoff samhandlingene som definerer selve grunnprinsippet for denne immunanalyse og gjengi resultater som er uninterpretable.
Denne analysen er viktig med hensyn til eksisterende metoder for kvantifisering av flere grunner. Når kjører riktig, kan analysen formatet quantitate opp til 13 analytter fra et utvalg med langt mindre volumer enn ville bli pålagt å analysere prøven ved hjelp av tradisjonelle ELISA analyser. Denne analysen format også krever ikke dedikert instrumentering for å utføres. Dette er en fordel i forhold til andre tilsvarede perle-baserte immunanalyser som analysen kan kjøres på en rekke vanlige flyt cytometers.
Vitenskapelig undersøkelse rollen spilt av utskilles faktorer og cytokin nettverk i helse og sykdom utvider. Analysen formatet beskrevet i dette manuskriptet kan være et verdifullt verktøy for forskere søker å forstå disse mangefasettert og komplekse fenomener. Aktive biomedisinsk forskningsprogrammer begynner å utforske rollen cytokin nettverk i ikke bare områder som generalisert betennelse6, men også i sammenheng med spesifikke sykdomstilstander som åreforkalkning og kreft neuroinflammation 15,16,17. Utvilsomt, etterforskning vil fortsette å vokse i disse områdene som søk etter romanen therapeutics å behandle disse kroniske tilstander utvides. Behovet for nøyaktig og pålitelig kvantifisering av løselig meglere forbundet med disse sykdommene vil være en kritisk forskning prioritet.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å erkjenne bidrag Biomarkers og immun-analyser produktutvikling team til utviklingen av analysen. I tillegg vil vi gjerne takke Vigene Tech, Inc. for deres felles anstrengelser i å utforme data analyse programvarepakkene.
Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor | Beckman Coulter | 366816 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel | BioLegend | 740005 | Multiplex Immunoassay (13-plex) |
Anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100314 | Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format |
Anti-mouse CD28 antibody | BioLegend | 102112 | Clone 37.51, low endotoxin, azide free format |
Vacuum Pump | EMD Millipore | WP6111560 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
Vacuum Manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
Sterile Disposable Reagent Reservoirs | Fisher Scientific | 07-200-130 | Or equivalent |
Polypropylene MicroFACS Tubes | Fisher Scientific | 11-842-90 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
Pipette Kit | Fisher Scientific | 14-388-100 | Four pipette sizes (0.2-2µL, 2-20µL, 20-200µL, 100-1000µL) |
Multi-Channel Pipette | Fisher Scientific | FA10011G | capable of dispensing 5 μL to 200 μL |
Microplate Shaker | Fisher Scientific | 88880023 | Or equivalent |
Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002410 | Or equivalent |
FACS tubes | Fisher Scientific | NC9885747 | 12 x 75 mm round bottom |
PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L-8274 | Escherichia coli O26:B6 |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Branson B200 Ultrasonic Cleaner | Sigma-Aldrich | Z305359 | Or equivalent |
Microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | 1.5 mL polypropylene tubes |
Flow Cytometer | Various | Various | Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm |
96-Well Polypropylene Plate | VWR | 82050-662 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |