Måle influensa nøytralisere antistoff Svar å A(H3N2) virus i menneskelig Sera av Microneutralization søk ved hjelp av MDCK-SIAT1 celler
Summary
Influensa nøytraliserende antistoffer samsvarer med beskyttelse av influensa infeksjoner. Microneutralization analyser måler nøytraliserende antistoffer i menneskelig sera, og brukes ofte til influensa menneskelige serologi. Vi beskriver en microneutralization analysen ved hjelp av MDCK-SIAT1 celler for å måle nøytraliserende antistoff titers moderne 3C.2a og 3C.3a A(H3N2) virus etter influensa vaksinasjon eller infeksjon.
Abstract
Nøytraliserende antistoffer mot hemagglutinin (HA) av influensavirus er betraktet som den viktigste immune mekanismen som samsvarer med beskyttelse for influensa infeksjoner. Microneutralization (MN) analyser brukes ofte til å måle nøytraliserende antistoff tiltak i menneskelige sera etter influensa vaksinasjon eller infeksjon. Madine Darby hjørnetann nyre (MDCK) celler er brukte cellen substrater for MN analyser. Men endret for tiden sirkulerer 3C.2a og 3C.3a A(H3N2) influensa virus har fått reseptor bindende spesifisitet. MDCK-SIAT1 celle linje med økt α-2,6 sialic galaktose moieties på overflaten har vist seg for å gi forbedret infectivity og mer trofast replikeringer enn konvensjonelle MDCK celler for disse moderne A(H3N2) virus. Her beskriver vi en MN analysen ved hjelp av MDCK-SIAT1 celler som er optimalisert for å kvantifisere nøytraliserende antistoff titers disse moderne A(H3N2) virus. I denne protokollen, er varme inaktivert sera inneholder nøytraliserende antistoffer først serielt utvannet, deretter inkubert med 100 TCID50/godt av A(H3N2) influensavirus tillate antistoffer i sera binde til virus. MDCK-SIAT1 celler er da lagt til virus-antistoff blanding, og ruges i 18-20 h på 37 ° C, 5% CO2 å tillate A(H3N2) virus å infisere MDCK-SIAT1 celler. Etter natten inkubasjon plater er fast og mengden av virus i hver godt er kvantifisert ved enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA) bruker anti-influensa en nucleoprotein (NP) monoklonale antistoffer. Nøytralisere antistoff titer er definert som den resiproke verdien av den høyeste serum fortynning som gir ≥50% hemming av virus infectivity.
Introduction
Influensavirus fortsetter å forårsake sykelighet og dødelighet i befolkningen hvert år. HA er den store overflaten glykoprotein av influensavirus. Nøytraliserende antistoffer målretting HA er den viktigste immune mekanismen som samsvarer med beskyttelse av influensa infeksjon1,2. Hemagglutination hemming (HI) analyser og MN analyser er to metoder som er mye brukt til å måle antistoff tiltak i menneskelige sera etter influensa infeksjon eller vaksinasjon3. HI analysen er måler antistoffer hemming av virus hemagglutination av røde blodlegemer og en surrogat analysen. I motsetning til Hei, kan MN analysen direkte måle nivåene av antistoffer i menneskelig sera som nøytraliserer influensa infeksjon i cellekulturer. MDCK celler brukes ofte influensa virus isolert og MN søk4.
Influensavirus gjennomgå stadig antigen drift og SKIFT, anskaffe mutasjoner på HA proteiner som kan endre reseptor bindende spesifisitet av virus. Siden 2014, nye klynger A(H3N2) virus dukket opp og fortsatte å sirkulere til inneværende sesong. Fleste av disse virusene tilhører genetisk gruppe 3C.2a og 3C.3a basert på fylogenetisk analyse av HA proteiner. Mange av sirkulerende 3C.2a virus hadde redusert evne til å hemagglutinate røde blodlegemer og derfor ikke kan være preget av HI analyser5. Nøytralisering analyser må brukes til å måle antistoff svarene på disse virusene som ikke hemagglutinate6. Videre har studier vist at disse moderne A(H3N2) virus har endret reseptor bindingsegenskapene sammenlignet med tidligere A(H3N2) virus og pleier å akkumulere kultur tilpasset mutasjoner og polymorfisme når passaged i i vitro celle kulturer7,8,9. Sammenlignet med konvensjonelle MDCK celler, er MDCK-SIAT1 en celle linje utviklet av Matrosovich et al. gjennom stabil transfection MDCK celler med cDNA av menneskelig α2, 6-sialtransferase (SIAT1). Denne cellen linje uttrykker økte mengder α2, 6-sialic galaktose moieties og redusert mengden α2, 3-sialic syre moieties enn overordnet MDCK celler10. MDCK-SIAT1 celler har vist seg for å forbedre isolasjon priser for A(H3N2) virus sammenlignet MDCK celler11. Lin et al. nylig rapportert at nylig dukket opp 3C.2a og 3C.3a menneskelig A(H3N2) influensa virus, mer trofast virus replikeringer og bedre virus infectivity ble oppnådd når virus ble dyrket i MDCK-SIAT1 cellelinjer sammenlignet med MDCK celler7. Dermed er MDCK-SIAT1-celler bedre egnet i MN analyser som karakteriserer antistoff svar til siste klynger A(H3N2) virus.
Her beskriver vi en MN analysen ved hjelp av MDCK-SIAT1 celler for å måle antistoff svar til moderne 3C.2a og 3C.3a A(H3N2) virus i menneskelig sera. Virus vokst i egg eller celler kan brukes i denne analysen. Varme inaktivert sera inneholder nøytraliserende antistoffer er først serielt utvannet, deretter inkubert med 100 TCID50/vel av A(H3N2) influensavirus tillate antistoffer i sera binde til virus. MDCK-SIAT1 celler er da lagt til virus-antistoff blanding, og ruges i 18-20 h på 37 ° C, 5% CO2 å tillate A(H3N2) virus å infisere MDCK-SIAT1 celler og gjenskape. Etter natten inkubasjon platene er løst og mengden av virus i hver brønn er kvantifisert ved en ELISA bruker anti-influensa A NP monoklonale antistoffer. Gjenkjenning av NP indikerer tilstedeværelse av virusinfeksjon og fravær av nøytralisere antistoffer. Nøytralisere antistoff titer er definert som den resiproke verdien av den høyeste serum fortynning som gir ≥ 50% hemming av virus infectivity.
Protocol
Representative Results
Discussion
MN analysen er en av de viktigste analyser brukes for influensa serologi for å oppdage antistoff svar etter influensa infeksjon eller vaksinasjon. Titers generert fra MN analyser er ofte brukt som primære utfallet av mange influensa seroepidemiology studier. MN analyser er også mye brukt for gjennomføre-diagnose og evaluering av vaksine immunogenisitet. Internasjonale mellom laboratorium studier har vært gjennomført for å sammenligne MN analyser utført i flere laboratorier14.
<p class=…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Xiuhua Lu, Dr. Feng Liu og Ms. Ashley Burroughs fra influensa divisjon av CDC for deres kritisk gjennomgang og hjelp i forberedelsene til denne oppgaven. Vi takker Dr. Adrian Reber fra influensa divisjon av CDC for hans hjelp forberede grafikken Figur3. Til slutt, vi takker Dr. M. Matrosovich, Marburg, Tyskland for å gi MDCK-SIAT1-celler.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose | Life Science | 11965 | A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free | Sigma-Aldrich | 3117332001 | |
| L-Glutamine | Life Science | 25030-081 | |
| Sodium pyruvate | Life Science | 11360-070 | |
| Geneticin G-418 disulfate salt | Sigma-Aldrich | A1720-5G | |
| HEPES | Life Science | 15630-080 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Science | 15140-122 | |
| Acetone | VWR | 67-64-1 | Used at an 80% concentration |
| Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate | Sigma-Aldrich | SLBF2806V | |
| O-Phenylenediamine Dihydrochloride tablet | Sigma-Aldrich | SLBQ1086V | 1 tablet per 100ml of cell culture grade water |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A510-P500 | Used 0.5M final concentration |
| Ethanol, Denatured, 4L | VWR | EM-AX0422-3 | Used at an 70% concentration |
| Trypsin-EDTA | Life Science | 1748048 | |
| RDE II "Seiken" | Denka Seiken | 370013 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-500ml | |
| Anti-NP mouse monoclonal Ab | Millipore pool | MAB 8257 MAB 8258 | |
| Anti-mouse IgG HRP | KPL | 074-1802 | |
| 96-well flat-bottom plates | Thermo Scientific | 3455 | |
| Plate reader | Molecular Device | Spectromax 384 plus | |
| Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap | Corning/VWR | 3151 |
References
- Reber, A., Katz, J. Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection. Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).
- Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. Correlates of protection against influenza infection in humans–on the path to a universal vaccine?. Curr Opin in Immunol. 25, 470-476 (2013).
- WHO Global Influenza Surveillance Network. . Manual for the labratory diagnosis and virological surveillence of influenza. , (2011).
- Govorkova, E. A., Kodihalli, S., Alymova, I. V., Fanget, B., Webster, R. G. Growth and immunogenicity of influenza viruses cultivated in Vero or MDCK cells and in embryonated chicken eggs. Dev Biological Stand. 98, 39-51 (1999).
- Levine, M. Z., et al. Neutralizing Antibody Responses to Antigenically Drifted Influenza A(H3N2) Viruses among Children and Adolescents following 2014-2015 Inactivated and Live Attenuated Influenza Vaccination. Clin Vaccine Immunol : CVI. 23, 831-839 (2016).
- Lin, Y., et al. The characteristics and antigenic properties of recently emerged subclade 3C.3a and 3C.2a human influenza A(H3N2) viruses passaged in MDCK cells. Influenza Other Respir Viruses. , (2017).
- Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment?. J of Virol. 84, 6769-6781 (2010).
- Skowronski, D. M., et al. Mutations acquired during cell culture isolation may affect antigenic characterisation of influenza A(H3N2) clade 3C.2a viruses. Euro Surveillance. 21, 30112 (2016).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2,6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J of Virol. 77, 8418-8425 (2003).
- Oh, D. Y., Barr, I. G., Mosse, J. A., Laurie, K. L. MDCK-SIAT1 cells show improved isolation rates for recent human influenza viruses compared to conventional MDCK cells. J Clin Microbiol. 46, 2189-2194 (2008).
- US Department of Health and Human Services. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2009).
- Reed, H. M. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, (1938).
- Laurie, K. L., et al. International Laboratory Comparison of Influenza Microneutralization Assays for A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and A(H5N1) Influenza Viruses by CONSISE. Clinical Vaccine Immunol : CVI. 22, 957-964 (2015).
- Lin, Y., Gu, Y., McCauley, J. W. Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay. J Vis Exp : JoVE. , (2016).
- van Baalen, C. A., et al. ViroSpot microneutralization assay for antigenic characterization of human influenza viruses. Vaccine. 35, 46-52 (2017).
