Mäta influensa neutraliserande antikroppen Svaren till A(H3N2) virus i Humansera av mikroneutraliserings-analyser med MDCK-SIAT1 celler
Summary
Influensa neutraliserande antikroppar korrelerar med skydd av influensainfektioner. Mikroneutraliserings analyser mäta neutraliserande antikroppar i humant serum och används ofta för influensa mänskliga serologi. Vi beskriver en mikroneutraliserings-analys med MDCK-SIAT1 celler för att mäta neutraliserande antikropp titrar för modern 3C.2a och 3C.3a A(H3N2) virus efter vaccination mot säsongsinfluensa eller infektion.
Abstract
Neutraliserande antikroppar mot hemagglutinin (HA) av influensavirus anses den viktigaste immunmekanism som korrelerar med skydd för influensainfektioner. Mikroneutraliserings (MN) analyser används ofta för att mäta neutraliserande antikroppssvaret hos Humansera efter vaccination mot säsongsinfluensa eller infektion. Madine Darby Canine njure (MDCK) celler är den vanligaste cell substraten för MN analyser. Dock förändrat för närvarande cirkulerar 3C.2a och 3C.3a A(H3N2) influensa virus har förvärvat receptor bindande specificitet. MDCK-SIAT1 cell raden med ökad α-2,6 sialic galaktos beståndsdelarna på ytan har visat sig ge förbättrad smittsamhet och mer trogna reproduktioner än konventionella MDCK celler för dessa samtida A(H3N2) virus. Här beskriver vi ett MN analysmetod med MDCK-SIAT1 celler som har optimerats för att kvantifiera neutraliserande antikropp titrar till dessa samtida A(H3N2) virus. I detta protokoll, värme inaktiverat sera som innehåller neutraliserande antikroppar först seriellt spädas ut, sedan inkuberas med 100 TCID50/väl av influensa A(H3N2) virus att tillåta antikroppar i sera att binda till virus. MDCK-SIAT1 celler är sedan lagts till virus-antikropp blandningen, och inkuberas i 18-20 h vid 37 ° C, 5% CO2 att tillåta A(H3N2) virus att infektera MDCK-SIAT1 celler. Efter natten inkubation, plattorna är fasta och mängden virus i varje väl kvantifieras i en enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) använder anti-influensa en nucleoprotein (NP) monoklonala antikroppar. Neutraliserande antikroppar Titern definieras som det reciproka värdet av den högsta spädning av serumet som ger ≥50% hämning av virus smittsamhet.
Introduction
Influensavirus fortsätter att orsaka sjuklighet och dödlighet i den mänskliga befolkningen varje år. HA är den stora ytan glykoprotein influensavirus. Neutraliserande antikroppar inriktning HA är den huvudsakliga immunmekanism som korrelerar med skydd av influensa infektion1,2. Hemagglutination hämning (HI) analyser och MN analyser är två metoder som ofta används för att mäta antikroppssvaret hos Humansera efter influensa infektion eller vaccination3. HI analysen mäter antikroppar hämning av virus hemagglutination av röda blodkroppar och anses vara en surrogat-analysen. Till skillnad från HI, kan MN analysen direkt mäta nivåerna av antikroppar i humant serum som neutralisera influensainfektion i cellodlingar. MDCK celler används ofta i influensa virusisolering och MN analyser4.
Influensavirus genomgår ständigt antigendrift och Skift, förvärva mutationer på HA proteiner som kan förändra receptor bindande specificitet virus. Sedan 2014 nya kluster av A(H3N2) virus uppstått och fortsatte att cirkulera tills innevarande säsong. Majoriteten av dessa virus hör till genetisk grupp 3C.2a och 3C.3a baserat på fylogenetisk analys av HA proteiner. Många av de cirkulerande virus som 3C.2a hade nedsatt förmåga till hemagglutinate röda blodkroppar och därför inte kan karakteriseras av HI analyser5. Neutralisering analyser måste användas för att mäta antikroppssvaret mot dessa virus som inte hemagglutinate6. Vidare har studier visat att dessa samtida A(H3N2) virus har ändrat receptor bindande egenskaper jämfört med tidigare A(H3N2) virus och tenderar att ackumuleras kultur anpassad mutationer och polymorfism när överförda i in vitro- cell kulturer7,8,9. Jämfört med konventionella MDCK celler, är MDCK-SIAT1 en cellinje som utvecklats av Matrosovich et al. genom stabila transfection MDCK celler med cDNA av mänskliga α2, 6-sialtransferase (SIAT1). Denna cellinje uttrycker ökade mängder α2, 6-sialic galaktos beståndsdelarna och minskade mängder av α2, 3-sialic acid beståndsdelarna än överordnat MDCK celler10. MDCK-SIAT1 celler har visat sig förbättra isolering priser för A(H3N2) virus jämfört med MDCK celler11. Nyligen, Lin et al. rapporterade att för nyligen framkom 3C.2a och 3C.3a mänskliga A(H3N2) influensavirus, mer trogen virus replikeringar och bättre virus smittsamhet uppnåddes när virus var odlade i MDCK-SIAT1 cellinjer jämfört med MDCK celler7. Således passar bättre MDCK-SIAT1 cellerna i MN analyser att karakterisera antikroppssvaret mot senaste kluster av A(H3N2) virus.
Här beskriver vi ett MN assay med MDCK-SIAT1 celler för att mäta antikroppssvaret mot moderna 3C.2a och 3C.3a A(H3N2) virus i Humansera. Virus som odlas i antingen ägg eller celler kan användas i denna analys. Värme inaktiverat sera som innehåller neutraliserande antikroppar först seriellt spädas ut, sedan inkuberas med 100 TCID50/väl av influensa A(H3N2) virus att tillåta antikroppar i sera att binda till viruset. MDCK-SIAT1 celler är sedan lagts till virus-antikropp blandningen, och inkuberas i 18-20 h vid 37 ° C, 5% CO2 att tillåta A(H3N2) viruset infektera MDCK-SIAT1 celler och replikera. Efter natten inkubation, plattorna är fasta och mängden virus i varje brunn kvantifieras i ELISA med anti-influensa A NP monoklonala antikroppar. Påvisande av NP indikerar förekomst av virusinfektion och avsaknad av neutraliserande antikroppar. Neutraliserande antikroppar Titern definieras som det reciproka värdet av den högsta spädning av serumet som ger ≥ 50% hämning av virus smittsamhet.
Protocol
Representative Results
Discussion
MN analysen är en av de viktigaste analyser som används för influensa serologi för att påvisa antikroppssvar efter influensainfektion eller vaccination. Titrar som genereras från MN analyser används ofta som det primära resultatet av många influensa seroepidemiology studier. MN analyser används också allmänt för sero-diagnos och utvärdering av vaccin immunogenicitet. Internationella Inter lab studier har utförts för att jämföra MN analyser utförs i flera laboratorier14.
<p c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Xiuhua Lu, Dr Feng Liu och Ms. Ashley Burroughs från influensa uppdelningen av CDC för kritisk granskning och hjälp i utarbetandet av detta manuskript. Vi tackar Dr. Adrian Reber från influensa Division av CDC för hans hjälp förbereda grafik av figur 3. Slutligen, vi tackar Dr. M. Matrosovich, Marburg, Tyskland för att ge MDCK-SIAT1 cellerna.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose | Life Science | 11965 | A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free | Sigma-Aldrich | 3117332001 | |
| L-Glutamine | Life Science | 25030-081 | |
| Sodium pyruvate | Life Science | 11360-070 | |
| Geneticin G-418 disulfate salt | Sigma-Aldrich | A1720-5G | |
| HEPES | Life Science | 15630-080 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Science | 15140-122 | |
| Acetone | VWR | 67-64-1 | Used at an 80% concentration |
| Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate | Sigma-Aldrich | SLBF2806V | |
| O-Phenylenediamine Dihydrochloride tablet | Sigma-Aldrich | SLBQ1086V | 1 tablet per 100ml of cell culture grade water |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A510-P500 | Used 0.5M final concentration |
| Ethanol, Denatured, 4L | VWR | EM-AX0422-3 | Used at an 70% concentration |
| Trypsin-EDTA | Life Science | 1748048 | |
| RDE II "Seiken" | Denka Seiken | 370013 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-500ml | |
| Anti-NP mouse monoclonal Ab | Millipore pool | MAB 8257 MAB 8258 | |
| Anti-mouse IgG HRP | KPL | 074-1802 | |
| 96-well flat-bottom plates | Thermo Scientific | 3455 | |
| Plate reader | Molecular Device | Spectromax 384 plus | |
| Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap | Corning/VWR | 3151 |
References
- Reber, A., Katz, J. Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection. Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).
- Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. Correlates of protection against influenza infection in humans–on the path to a universal vaccine?. Curr Opin in Immunol. 25, 470-476 (2013).
- WHO Global Influenza Surveillance Network. . Manual for the labratory diagnosis and virological surveillence of influenza. , (2011).
- Govorkova, E. A., Kodihalli, S., Alymova, I. V., Fanget, B., Webster, R. G. Growth and immunogenicity of influenza viruses cultivated in Vero or MDCK cells and in embryonated chicken eggs. Dev Biological Stand. 98, 39-51 (1999).
- Levine, M. Z., et al. Neutralizing Antibody Responses to Antigenically Drifted Influenza A(H3N2) Viruses among Children and Adolescents following 2014-2015 Inactivated and Live Attenuated Influenza Vaccination. Clin Vaccine Immunol : CVI. 23, 831-839 (2016).
- Lin, Y., et al. The characteristics and antigenic properties of recently emerged subclade 3C.3a and 3C.2a human influenza A(H3N2) viruses passaged in MDCK cells. Influenza Other Respir Viruses. , (2017).
- Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment?. J of Virol. 84, 6769-6781 (2010).
- Skowronski, D. M., et al. Mutations acquired during cell culture isolation may affect antigenic characterisation of influenza A(H3N2) clade 3C.2a viruses. Euro Surveillance. 21, 30112 (2016).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2,6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J of Virol. 77, 8418-8425 (2003).
- Oh, D. Y., Barr, I. G., Mosse, J. A., Laurie, K. L. MDCK-SIAT1 cells show improved isolation rates for recent human influenza viruses compared to conventional MDCK cells. J Clin Microbiol. 46, 2189-2194 (2008).
- US Department of Health and Human Services. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2009).
- Reed, H. M. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, (1938).
- Laurie, K. L., et al. International Laboratory Comparison of Influenza Microneutralization Assays for A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and A(H5N1) Influenza Viruses by CONSISE. Clinical Vaccine Immunol : CVI. 22, 957-964 (2015).
- Lin, Y., Gu, Y., McCauley, J. W. Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay. J Vis Exp : JoVE. , (2016).
- van Baalen, C. A., et al. ViroSpot microneutralization assay for antigenic characterization of human influenza viruses. Vaccine. 35, 46-52 (2017).
