Визуализация внеклеточного ловушки макрофагов с помощью конфокальной микроскопии
Summary
Макрофагов внеклеточного ловушки являются недавно описан сущности. Эта статья будет сосредоточена на confocal микроскопии методов и как они отображаются в пробирке и в естественных условиях от образцов легких.
Abstract
Основной метод, используемый для определения присутствия нейтрофилов внеклеточного ловушки (сетки) является confocal микроскопии. Мы изменили методы установленных confocal микроскопии визуализировать макрофагов внеклеточного ловушки (Мец). Эти внеклеточные ловушек определяются наличием внеклеточного хроматина с одним выражением других компонентов, таких как зерно протеаз, citrullinated гистонами и peptidyl arginase deiminase (PAD). Выражение Мец обычно измеряется после воздействия на раздражитель и по сравнению с ООН стимулировали образцов. Образцы также включены для фона и изотипа управления. Клетки анализируются с помощью программного обеспечения для анализа четкие изображения. Конфокальная микроскопия может использоваться для определения присутствия Мец как in vitro , так и в естественных условиях в легочной ткани.
Introduction
Нейтрофильные внеклеточного ловушки (сетки), были впервые описаны, Бринкманн et al. 1 они преимущественно производятся в ответ на инфекцию (особенно для бактерий) и имеют важную роль в принимающей обороны1,2. Они также были описаны в ответ на неинфекционных заболеваний, в том числе васкулит и системная красная волчанка (СКВ); и с Митоген phorbol 12-myrisate 13-ацетат (PMA)2,3. Недавно было признано, что другие типы клеток может также производить внеклеточные ловушки, включая макрофагов. Внеклеточные ловушки макрофагов (Мец) еще не четко определенной сущности в литературе4,5. Недавно мы создали методы для обнаружения присутствия Мец как in vitro и in vivo6,7. В этой статье будут описаны измерения с помощью конфокальной микроскопии Мец.
Основные черты NETosis, которые отличают его от других сотовых пути (например, апоптоз8) экструзии хроматина в сочетании с: (1) citrullination гистонами (H3Cit)9, (2) совместно выражение гранул протеаз10 и (3) участии peptidyl аргинин deiminase (PAD) 411,12. Макрофаги также выразить H3Cit, гранул протеаз и PAD, и эти функции могут использоваться для определения присутствия Мец.
Мец может иметь особенно важную роль в легких, как макрофагов является доминирующей в альвеолы и авиалинии легкя и первоначальный роль в управлении клеточный иммунный ответ на инфекции/воспаление. Кроме того в то время как большая часть легких является пустое пространство (например, в альвеолы), Мец потенциально способны расширить пространство, в отличие от солидных органов.
Наиболее широко используемый метод для определения наличия сетей является confocal микроскопии. Четко определенный способ измерить Мец еще не существует. Техника для измерения сеток была адаптирована для измерения присутствия Мец в настоящем Протоколе. Основные требования для данного метода являются доступ к confocal микроскопии и соответствующих изображений программное обеспечение для анализа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод, описанный в данном обзоре основан на который используется для определения присутствия сети14. Макрофаги являются на сегодняшний день доминирующей ячейки типа в образцах бал, и этот метод коллекции особенно подходит для изучения Мец. Если красные кровяные клетки при?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась грантов от университета Монаш, национального здравоохранения и медицинский исследовательский совет, Monash легких и сна института. Авторы хотели бы поблагодарить сотрудников клинической иммунологии в Монаш здравоохранения, Джуди Callaghan, Алекс Фульхерий, Кирстин Elgass и Камден Ло в Монаш микро Imaging (MMI) за помощь с confocal микроскопии изображений, и авторы признают услуги MMI университета Монаш. Авторы признают, зал и научной и технической помощи Монаш гистология платформы.
Materials
| Human samples: Primary antibodies | |||
| Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-human MMP12 | Novus Biological | NB110-57214 | 1:100 concentration not quantifiable |
| Mouse anti-human MMP9 | Novus Biological | AB119906 | 1:200 ascites, no concentration given |
| Rabbit anti-human PADI2/PAD2 | Abcam | AB16478 | 7 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Sheep anti-human NE | LifeSpan Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse samples: Primary antibodies | |||
| Goat anti-mouse MMP9 | Abcam | AF909 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rat anti-mouse F4/80 | In-house (hybridoma) | In house | 20 ug/ml |
| Sheep anti-human Anti-HNE /NE | Sapphire Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Super-frost plus slides | Menzel | S41104A | |
| Dapi-prolong gold | Molecular probes | P36931 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 85111 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | E9434 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Chicken anti-rabbit AF 488/ | Life technologies | A-21441 | |
| Chicken anti-rabbit AF 594 | Life technologies | A-21442 | |
| Chicken anti-goat AF 594 | Life technologies | a-21468 | |
| Chicken anti-mouse AF488 | Life technologies | A-21200 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11018 | |
| Chicken anti-mouse AF 647 | Life technologies | A-21463 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11016 | |
| Isotype control | |||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG1 | BD Bioscience | 550878 | |
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG2a | BioLegend | 400201 | |
| Sheep IgG | In house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software Programs | |||
| Imaris | Bitplane | ||
| Image J | NIH | ||
| To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| C1 Confocal scanning microscope | Nikon | ||
| FV1200 Confocal scanning microscope | Olympus | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue sources | |||
| Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre | |||
| Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media | |||
| RPMI | Sigma-Aldrich | r8758 | |
| Fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other reagents | |||
| Sudan black | Sigma-Aldrich | 199664 | |
| paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative | Sigma-Aldrich | 27387 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 | |
| Natural formalin | Sigma-Aldrich | 42904 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327204 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | |
| Solvent 3B | Hi-Chem | 2026 | |
| Coverslips 12 ml | Sigma-Aldrich | S1815 | |
| Coverslips 60 x 24 ml | Sigma-Aldrich | C6875 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| c57 black 6 | Monash animal research platform (MARP) | ||
| BALB/c | MARP |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers immunol. 4, 1 (2013).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PloS one. 10 (3), e0120371 (2015).
- O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).
- Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. Activation of PAD4 in NET formation. Front Immunol. 3, 360 (2012).
- Lewis, H. D., et al. Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation. Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).
- Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema. Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).
- Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Wong, K. W., Jacobs, W. R. Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis. J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).
