Makrofaj hücre dışı tuzaklar Confocal mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi
Summary
Makrofaj hücre dışı tuzakları yeni açıklanan bir varlık vardır. Bu makale confocal mikroskobu yöntemleri üzerinde konsantre ve nasıl olduklarını vitro ve in vivo akciğer örneklerinden görüntülenir.
Abstract
Confocal mikroskobu, nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar) varlığı tanımlamak için kullanılan bir birincil yöntemidir. Makrofaj hücre dışı tuzakları (METs) görselleştirmek için kurulan confocal mikroskobu yöntemleri değiştirdiniz. Bu hücre dışı tuzakları ekstraselüler Kromatin varlığı granül proteaz, citrullinated Histon ve peptit arginase deiminase (PAD) gibi diğer bileşenlerinin ortak ifade ile tanımlanır. METs ifade genellikle bir uyarana maruz kaldıktan sonra ölçülen ve un uyarılmış örnekleri karşılaştırıldığında. Örnekleri de arka plan ve izotip kontrol için yer almaktadır. Hücreleri iyi tanımlanmış görüntü analiz yazılımı kullanılarak analiz edilir. Confocal mikroskobu METs varlığı tanımlamak için kullanılan vitro ve in vivo akciğer dokusunda.
Introduction
Nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar), ilk olarak Brinkmann vd tarafından açıklanan 1 onlar enfeksiyon (özellikle bakteri) yanıt olarak ağırlıklı olarak üretilen ve konak savunma1,2‘ önemli bir role sahiptir. Onlar da yanıt olmayan bulaşıcı hastalık, vaskülit ve sistemik lupus Eritematozus (SLE); de dahil olmak üzere için gerçekleşmesi için tarif edilmistir ve mitojenle phorbol 12-myrisate 13-asetat (PMA)2,3. Bu son zamanlarda diğer hücre tipleri aynı zamanda hücre dışı tuzakları, makrofajlar da dahil olmak üzere neden olabilir kabul edilmiştir. Makrofaj hücre dışı tuzakları (METs) henüz edebiyat4,5iyi tanımlanmış bir varlık değildir. Biz son zamanlarda METs olup olmadığını belirlemek için yöntemleri kurduk vitro ve in vivo6,7. Bu makalede, METs confocal mikroskobu kullanılarak ölçüm açıklanacaktır.
Kromatin ile birlikte ekstrüzyon (gibi Apoptozis8) hücresel diğer yolları ayırmak NETosis temel özellikleri şunlardır: (1) citrullination histonlarla (H3Cit)9, (2) ortak ifade granül proteaz10 ve peptit arginin deiminase (PAD) 4 (3) katılımı11,12. Makrofajlar da ifade H3Cit, granül proteaz ve PAD ve bu özellikler METs varlığı tanımlamak için kullanılabilir.
METs makrofaj baskın hücre mevcut alveoller ve akciğerin airways ve hücresel immün yanıt enfeksiyon/iltihap için yönetmenlik ilk rolü vardır akciğerde, özellikle önemli bir rolü olabileceğini. Akciğer çok boş alanı (örneğin, içinde alveoller), Ayrıca, METs içine belgili tanımlık yer elde edilebilir, sağlam organların aksine genişletmek potansiyel olarak mümkün iken.
NETs varlığı tanımlamak için en çok kullanılan tarafından confocal mikroskobu yöntemidir. Henüz METs ölçmek için açıkça tanımlanmış bir yol değil. NETs ölçme tekniği METs huzurunda bu protokolü ölçmek için adapte edilmiştir. Bu yöntemin temel gereksinimleri confocal mikroskobu ve uygun görüntüleme yazılımı erişim analizi için vardır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu derlemede açıklanan yöntemi tabanlı ağlar14varlığı tanımlamak için kullanılan tarih. Makrofajlar tarafından çok BAL örneklerinde baskın hücre tipi vardır ve bu yöntem koleksiyon METs eğitimi için özellikle uygundur. Kırmızı kan hücreleri içinde BAL varsa, bu hücreleri amonyum klorür kullanarak lysed. BAL yordam genellikle makrofajlar devreye giriyor ve bu nedenle bu METs un uyarılmış örnekleri mevcut olacak bekleniyor. BAL makrofajlar genellikle çok yapışık. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser hibe Monash Üniversitesi, Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi ve Monash akciğer ve uyku Enstitüsü tarafından finanse edildi. Yazarlar Imaging confocal mikroskobu ile Klinik İmmünoloji Monash sağlık, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass ve Camden Lo, Monash mikro Imaging (MMI) personel yardım için teşekkür etmek istiyorum ve yazarlar MMI İmkanları kabul Monash Üniversitesi. Yazarlar imkanları ve Monash Histoloji platformu bilimsel ve teknik yardım kabul edersiniz.
Materials
| Human samples: Primary antibodies | |||
| Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-human MMP12 | Novus Biological | NB110-57214 | 1:100 concentration not quantifiable |
| Mouse anti-human MMP9 | Novus Biological | AB119906 | 1:200 ascites, no concentration given |
| Rabbit anti-human PADI2/PAD2 | Abcam | AB16478 | 7 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Sheep anti-human NE | LifeSpan Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse samples: Primary antibodies | |||
| Goat anti-mouse MMP9 | Abcam | AF909 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rat anti-mouse F4/80 | In-house (hybridoma) | In house | 20 ug/ml |
| Sheep anti-human Anti-HNE /NE | Sapphire Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Super-frost plus slides | Menzel | S41104A | |
| Dapi-prolong gold | Molecular probes | P36931 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 85111 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | E9434 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Chicken anti-rabbit AF 488/ | Life technologies | A-21441 | |
| Chicken anti-rabbit AF 594 | Life technologies | A-21442 | |
| Chicken anti-goat AF 594 | Life technologies | a-21468 | |
| Chicken anti-mouse AF488 | Life technologies | A-21200 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11018 | |
| Chicken anti-mouse AF 647 | Life technologies | A-21463 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11016 | |
| Isotype control | |||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG1 | BD Bioscience | 550878 | |
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG2a | BioLegend | 400201 | |
| Sheep IgG | In house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software Programs | |||
| Imaris | Bitplane | ||
| Image J | NIH | ||
| To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| C1 Confocal scanning microscope | Nikon | ||
| FV1200 Confocal scanning microscope | Olympus | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue sources | |||
| Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre | |||
| Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media | |||
| RPMI | Sigma-Aldrich | r8758 | |
| Fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other reagents | |||
| Sudan black | Sigma-Aldrich | 199664 | |
| paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative | Sigma-Aldrich | 27387 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 | |
| Natural formalin | Sigma-Aldrich | 42904 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327204 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | |
| Solvent 3B | Hi-Chem | 2026 | |
| Coverslips 12 ml | Sigma-Aldrich | S1815 | |
| Coverslips 60 x 24 ml | Sigma-Aldrich | C6875 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| c57 black 6 | Monash animal research platform (MARP) | ||
| BALB/c | MARP |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers immunol. 4, 1 (2013).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PloS one. 10 (3), e0120371 (2015).
- O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).
- Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. Activation of PAD4 in NET formation. Front Immunol. 3, 360 (2012).
- Lewis, H. D., et al. Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation. Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).
- Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema. Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).
- Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Wong, K. W., Jacobs, W. R. Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis. J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).
