Visualisere makrofag ekstracellulære fælder ved hjælp af konfokalmikroskopi
Summary
Makrofag ekstracellulære fælder er en nyligt beskrevne enhed. Denne artikel vil koncentrere sig om Konfokal mikroskopi metoder og hvordan de er visualiseret i vitro og vivo fra lunge prøver.
Abstract
En primære metode bruges til at definere tilstedeværelsen af neutrofile ekstracellulære fælder (NETs) er Konfokal mikroskopi. Vi har ændret etablerede Konfokal mikroskopi metoder til at visualisere makrofag ekstracellulære fælder (METs). Disse ekstracellulære fælder er defineret ved tilstedeværelsen af ekstracellulære kromatin med co udtryk for andre komponenter såsom granulet proteaser, citrullinated histoner og peptidyl arginase deiminase (PAD). METs udtryk er generelt målt efter udsættelse for en stimulus og i forhold til un-stimuleret prøver. Prøverne er også inkluderet for baggrund og isotype kontrol. Cellerne analyseres ved hjælp af veldefinerede billede analyse software. Konfokal mikroskopi kan bruges til at definere tilstedeværelsen af METs både in vitro- og vivo i lungevæv.
Introduction
Neutrofile ekstracellulære fælder (net), blev første gang beskrevet af Brinkmann et al. 1 de er overvejende produceret som reaktion på infektion (især for bakterier) og har en vigtig rolle i vært forsvar1,2. De er også blevet beskrevet til at opstå som reaktion på ikke-smitsomme sygdomme, herunder vaskulitis og systemisk lupus erythematosus (SLE); og at den mitogen phorbol 12-myrisate 13-acetat (PMA)2,3. Det er for nylig blevet anerkendt, at andre celletyper kan også producere ekstracellulære fælder, herunder makrofager. Makrofag ekstracellulære fælder (METs) er endnu ikke en veldefineret enhed i litteratur4,5. Vi har for nylig etableret metoder til paavisning af METs både in vitro- og i vivo6,7. I denne artikel beskrives måling af METs bruger Konfokal mikroskopi.
Nøglen egenskaber i NETosis, som adskiller det fra andre cellulære veje (såsom apoptose8) er ekstrudering af kromatin i forbindelse med: (1) citrullinering histoner (H3Cit)9, (2) fælles udtryk af granulet proteaser10 , og (3) inddragelse af peptidyl arginin deiminase (PAD) 411,12. Makrofager også udtrykke H3Cit, granulet proteaser og PAD, og disse funktioner kan bruges til at definere tilstedeværelsen af METs.
METs kan have en særlig vigtig rolle i lungen, som makrofager er den dominerende celle i alveolerne og luftvejene i lungerne og har den oprindelige rolle i ledelsen af det cellulære immunrespons til infektion/inflammation. Desuden, mens meget af lungen er tomme rum (f.eks.inden for alveolerne), er METs potentielt kunne udvide i den plads, i modsætning til fast organer.
Den mest udbredte metode til at definere tilstedeværelsen af net er af Konfokal mikroskopi. Der er endnu ikke klart defineret måde at måle METs. Teknik til måling af redskaber er blevet tilpasset til at måle tilstedeværelsen af METs i denne protokol. De vigtigste krav for denne metode er adgang til Konfokal mikroskopi og passende imaging software til analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden i denne undersøgelse er baseret på, bruges til at definere tilstedeværelsen af NETs14. Makrofager er langt den dominerende celletype i BAL prøver og denne metode til indsamling er særligt velegnet til at studere METs. Hvis røde blodlegemer er til stede i BAL, bør disse celler mængden ved hjælp af ammoniumklorid. BAL procedure vil generelt aktivere makrofager og det forventes derfor at der vil være METs stede i un-stimuleret prøver. BAL makrofager er normalt meget klæbende. BAL …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra Monash University, National Health og Medical Research Council, og Monash lunge og søvn Institute. Forfatterne vil gerne takke personalet i klinisk immunologi ved Monash sundhed, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass og Camden Lo af Monash Micro Imaging (MMI) for at få hjælp med konfokalmikroskopi imaging, og forfatterne anerkender MMI faciliteter af Monash Universitet. Forfatterne anerkender faciliteter og videnskabelig og teknisk bistand af Monash histologi Platform.
Materials
| Human samples: Primary antibodies | |||
| Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-human MMP12 | Novus Biological | NB110-57214 | 1:100 concentration not quantifiable |
| Mouse anti-human MMP9 | Novus Biological | AB119906 | 1:200 ascites, no concentration given |
| Rabbit anti-human PADI2/PAD2 | Abcam | AB16478 | 7 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Sheep anti-human NE | LifeSpan Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse samples: Primary antibodies | |||
| Goat anti-mouse MMP9 | Abcam | AF909 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rat anti-mouse F4/80 | In-house (hybridoma) | In house | 20 ug/ml |
| Sheep anti-human Anti-HNE /NE | Sapphire Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Super-frost plus slides | Menzel | S41104A | |
| Dapi-prolong gold | Molecular probes | P36931 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 85111 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | E9434 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Chicken anti-rabbit AF 488/ | Life technologies | A-21441 | |
| Chicken anti-rabbit AF 594 | Life technologies | A-21442 | |
| Chicken anti-goat AF 594 | Life technologies | a-21468 | |
| Chicken anti-mouse AF488 | Life technologies | A-21200 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11018 | |
| Chicken anti-mouse AF 647 | Life technologies | A-21463 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11016 | |
| Isotype control | |||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG1 | BD Bioscience | 550878 | |
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG2a | BioLegend | 400201 | |
| Sheep IgG | In house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software Programs | |||
| Imaris | Bitplane | ||
| Image J | NIH | ||
| To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| C1 Confocal scanning microscope | Nikon | ||
| FV1200 Confocal scanning microscope | Olympus | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue sources | |||
| Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre | |||
| Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media | |||
| RPMI | Sigma-Aldrich | r8758 | |
| Fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other reagents | |||
| Sudan black | Sigma-Aldrich | 199664 | |
| paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative | Sigma-Aldrich | 27387 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 | |
| Natural formalin | Sigma-Aldrich | 42904 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327204 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | |
| Solvent 3B | Hi-Chem | 2026 | |
| Coverslips 12 ml | Sigma-Aldrich | S1815 | |
| Coverslips 60 x 24 ml | Sigma-Aldrich | C6875 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| c57 black 6 | Monash animal research platform (MARP) | ||
| BALB/c | MARP |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers immunol. 4, 1 (2013).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PloS one. 10 (3), e0120371 (2015).
- O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).
- Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. Activation of PAD4 in NET formation. Front Immunol. 3, 360 (2012).
- Lewis, H. D., et al. Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation. Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).
- Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema. Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).
- Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Wong, K. W., Jacobs, W. R. Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis. J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).
