Ein RANKL-basierte Osteoklasten Kultur Assay der Maus Knochenmark zu untersuchen, die Rolle von mTORC1 in Osteoklasten Bildung
Summary
Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zum isolieren und Kultur Osteoklasten in Vitro aus Maus Knochenmark und zur Untersuchung der Rolle von Säugetieren/mechanistischen Ziel von Rapamycin Komplex 1 in Osteoklasten-Formation.
Abstract
Osteoklasten sind einzigartige Knochen-resorbierbarem Zellen, die von der Monocyte/Makrophagen-Linie des Knochenmarks zu unterscheiden. Dysfunktion von Osteoklasten kann eine Reihe von metabolischen Knochenerkrankungen wie Osteoporose führen. Um pharmazeutische Ziele für die Vermeidung von krankhaften Knochenschwund Masse zu entwickeln, müssen die Mechanismen, durch die Osteoklasten aus Vorstufen unterscheiden, verstanden werden. Die Fähigkeit zu isolieren und eine große Anzahl von Osteoklasten in-vitro- Kultur ist entscheidend, um die Rolle bestimmter Gene in Osteoklasten Differenzierung bestimmen. Inaktivierung von Säugetieren/mechanistischen Ziel von Rapamycin Komplex 1 (TORC1) in Osteoklasten kann Osteoklasten Anzahl verringern und Knochenmasse zu erhöhen; jedoch bedürfen die zugrunde liegenden Mechanismen weiterer Untersuchungen. In der vorliegenden Studie wird ein RANKL-basiertes Protokoll zu isolieren und Kultur Osteoklasten aus Maus Knochenmark und Untersuchung des Einflusses von mTORC1 Inaktivierung auf Osteoklasten Formation beschrieben. Dieses Protokoll führte erfolgreich eine große Anzahl von riesigen Osteoklasten in der Regel innerhalb einer Woche. Löschen von Raptor beeinträchtigt Osteoklasten Bildung und nahm die Aktivität des sekretorischen Tartrat-resistente saure Phosphatase, anzeigend, dass mTORC1 für Osteoklasten Bildung entscheidend.
Introduction
Knochen ist ein ständig wechselnden Organ und wird von Osteoblasten und Osteoklasten zeitlebens umgebaut. Osteoklasten sind verantwortlich für mineralisierten Matrix Resorption und Osteoblasten zu synthetisieren und sezernieren neue Knochen Matrizen1. Die Balance zwischen Knochenabbau und Knochenaufbau ist entscheidend für die Knochengesundheit, einschließlich der Wartung der Knochen Masse und Reaktion auf Stimulation und Verletzungen. Wenn dieses Gleichgewicht gestört ist, kann eine Reihe von metabolischen Knochenerkrankungen wie Osteoporose und parodontale Erkrankungen auftreten. Bei diesen Erkrankungen übersteigt Knochen Masse Verlust infolge osteoclastic Knochenabbau Knochen bilden Kapazität von Osteoblasten2,3. So um pharmazeutische Ziele zur Behandlung von Skeletterkrankungen wie Osteoporose zu entwickeln, ist es wichtig zu verstehen, die Erzeugung und die Biologie der Osteoklasten4.
Osteoklasten sind einzigartige mehrkernigen Riesenzellen befindet sich an oder nahe der Knochenoberfläche und gehören zu der Familie Monocyte/Makrophagen-1. Ibbotson K. J. Et al. eine Methode zur Erzeugung Osteoklasten-wie Zellen in Vitro mit 1,25-Dihydroxy-Vitamin D35-haltigem Medium berichtet. Die Identifizierung von Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) und Rezeptor Aktivator für nukleare Faktor κ B Ligand (RANKL) als wesentliche Faktoren der Osteoklasten Bildung hat dramatisch zugenommen, die Effizienz der Osteoclastogenesis in vitro 1 , 6 , 7. die Möglichkeit, Kultur Osteoklasten in Vitro hat unser Verständnis der Generation und Regulierung der Osteoklasten verbessert.
Das Säugetier/mechanistischen Ziel von Rapamycin (mTOR) Funktionen in zwei strukturell und funktionell unterschiedliche komplexe, nämlich mTORC1 und mTORC28,9. Die zwei Multi-Protein-komplexe sind aufgrund ihrer unterschiedlichen Komponenten und nachgelagerten Substrate voneinander. mTORC1 enthält das einzigartige regulatorischen-assoziierten Protein mTOR (Raptor), während mTORC2 Rapamycin-unempfindliche Begleiter von mTOR (Rictor)9enthält. mTORC1 können integrieren und übertragen wichtige Signale, Zellwachstum, Proliferation und Differenzierung zu regulieren. Vor kurzem haben wir gezeigt, dass diese mTORC1 spielt eine Schlüsselrolle im Netzwerk der katabolen Knochenabbau durch Löschen des Raptor , mTORC1 in Osteoklasten10zu inaktivieren. Jedoch bedürfen die zugrunde liegenden Mechanismen weiterer Untersuchungen. In der vorliegenden Studie wurde eine Osteoclastogenic RANKL-basierte Methode Osteoklasten aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs) der Wildtyp (WT) und RapCtsk Mäuse zu generieren und Untersuchung des Einflusses von mTORC1 Inaktivierung auf Osteoklasten verwendet. Bildung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Osteoclastogenic-Assay ist die am weitesten verbreitete Methode zur Isolierung und Kultur Osteoklasten in-vitro-12,13. Während mehrere RANKL-basierte Osteoklasten Induktionen beschrieben13,14,15gewesen sein, beschrieben die vorliegende Studie ein Protokoll mit einigen Änderungen basierend auf den bisherigen Methoden.
In der vora…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Minghan Tong und S. Kato für freundlicherweise die Reagenzien und Mäuse. Wir danken die Mitgliedern des Zou Lab für nützliche Diskussionen. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch Zuschüsse von 973-Programm aus dem chinesischen Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST) [2014CB964704 und 2015CB964503], klinische Forschungsprogramm des 9. Volks Krankenhaus, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Danke für die Hilfe von Core Facility für Zellbiologie und Core Facility für chemische Biologie, CAS Zentrum für Exzellenz in der molekularen Zelle Wissenschaft, Shanghai Institut für Biochemie und Zellbiologie, Chinese Academy of Sciences.
Materials
| Raptorfl/fl mice | The Jackson Laboratory | 013188 | |
| Ctsk-cre mice | a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan | ||
| α-MEM | Corning | 10-022-CVR | |
| Glutamine | Gibico | 25030081 | |
| Penicillin streptomycin | Gibico | 15140122 | |
| Fetal calf serum | BioInd | 04-001-1A | |
| Recombinant mouse M-CSF protein | R&D | Q3U4F9 | |
| Recombinant mouse RANKL protein | R&D | Q3TWY5 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | 302643 | |
| Acetone | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Citrate solution | Sigma-Aldrich | 915 | |
| Formaldehyde solution | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | |
| Fast Garnet GBC Base solution | Sigma-Aldrich | 3872 | |
| Sodium Nitrite Solution | Sigma-Aldrich | 914 | |
| Naphthol AS-BI Phosphate Solution | Sigma-Aldrich | 3871 | |
| Acetate solution | Sigma-Aldrich | 3863 | |
| Tartrate solution | Sigma-Aldrich | 3873 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning | 21-031-CVR | |
| L-tartaric acid | Sigma-Aldrich | 251380 | |
| Sodium tartrate dibasic dehydrate | Sigma-Aldrich | s4797 | |
| Glycine | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| MgCl2 | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| ZnCl2 | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| NaOH | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Phosphatase substrate | Sigma-Aldrich | P4744 | |
| anti-Raptor | Cell Signaling Technology | 2280 | |
| anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236) | Cell Signaling Technology | 2317 | |
| anti-ribosomal protein S6 | Cell Signaling Technology | 2211 | |
| anti-β-actin | Santa Cruz Biotechnology | sc-130300 | |
| 37% formaldehyde | Xilong scientific | ||
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane | Bio-Rad | ||
| Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Millipore | 00000367MSDS | |
| IX71 | Olympus | ||
| Envision | Perkin Elmer | ||
| 0.45-mm Syringe | |||
| Scissor | |||
| Mosquito forcep |
References
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