מבוסס רנקל אוסטאוקלסט תרבות וזמינותו של העכבר מח העצם כדי לחקור את התפקיד של mTORC1 במבנה אוסטאוקלסט
Summary
כתב יד זה מתאר פרוטוקול כדי לנתק את ותרבות osteoclasts במבחנה ממח העצם העכבר, וכדי ללמוד את התפקיד של מטרת מידע יונקים/מכניסטית rapamycin 1 מורכבים במבנה אוסטאוקלסט.
Abstract
Osteoclasts הם ייחודיים עצם-resorbing תאים כי להבדיל מן השושלת מונוציט/מקרופאג של מח העצם. תפקוד לקוי של osteoclasts עלולה לגרום לסדרה של מחלות מטבוליות העצם, כולל אוסטיאופורוזיס. כדי לפתח מטרות תרופות למניעת איבוד מסת העצם פתולוגי, יש להבין את המנגנונים שבאמצעותו osteoclasts להבדיל סימנים מקדימים. היכולת לבודד תרבות מספר גדול של osteoclasts במבחנה הוא קריטי על מנת לקבוע את התפקיד של גנים ספציפיים אוסטאוקלסט בידול. איון של מטרת מידע יונקים/מכניסטית rapamycin מורכבים 1 (TORC1) של osteoclasts יכולים להקטין את מספר אוסטאוקלסט ולהגדיל את מסת העצם; עם זאת, המנגנון הבסיסי דורש מחקר נוסף. במחקר הנוכחי, פרוטוקול מבוסס רנקל לבודד, תרבות osteoclasts ממח העצם העכבר וכדי ללמוד את ההשפעה של איון mTORC1 על היווצרות אוסטאוקלסט מתואר. פרוטוקול זה הביא בהצלחה מספר רב של osteoclasts ענק, בדרך כלל תוך שבוע אחד. מחיקה של Raptor לקוי אוסטאוקלסט היווצרות וירידה הפעילות של הפרשה פוספטאז חומצה tartrate עמידים, המציין שאת mTORC1 הזה הוא קריטי עבור אוסטאוקלסט היווצרות.
Introduction
עצם הוא איבר המשתנה, היא שופצה על ידי תאי העצם osteoclasts לאורך החיים. Osteoclasts אחראים על בסיס מינרלים מן מטריקס resorption ותאי העצם לסנתז להפריש עצם חדש מטריצות1. האיזון בין ספיגת עצם היווצרות העצם היא חיונית לבריאות העצם כולל תחזוקה של העצם מסה ו בתגובה לגירוי ופציעה. אם איזון זה מופרת, סדרה של מחלות מטבוליות העצם עלולה להתרחש, כולל אוסטאופורוזיס ומחלות חניכיים. במחלות אלה, אובדן מסת עצם הנובע ספיגת עצם osteoclastic חורג העצם ויוצרים קיבולת של תאי העצם2,3. לכן, על מנת לפתח מטרות התרופות לטיפול בהפרעות השלד כגון אוסטיאופורוזיס, זה קריטי להבין את הדור ואת הביולוגיה של osteoclasts4.
Osteoclasts הם ייחודיים תאים multinucleated ענק הממוקם ליד או על פני עצם, שייך מונוציט/מקרופאג משפחה1. Ibbotson ק. י. ואח דיווח שיטה ליצירת תאים דמויי אוסטאוקלסט במבחנה בינונית המכיל 1,25-dihydroxy-ויטמין D35. זיהוי גורם מגרה מקרופאג-המושבה (M-CSF), קולטן activator עבור הפקטור הגרעיני-κ B ליגנד (רנקל) כגורמים חיוני היווצרות אוסטאוקלסט גדל באופן דרמטי את היעילות של osteoclastogenesis חוץ גופית בתוך 1 , 6 , 7. יכולת התרבות osteoclasts במבחנה השתפרה ההבנה שלנו של הדור וויסות של osteoclasts.
המטרה מידע יונקים/מכניסטית של פונקציות rapamycin (mTOR) שני מתחמי מבחינה מבנית והן מבחינה תפקודית ברורים, כלומר mTORC1 ו- mTORC28,9. שני מתחמי חלבון רב נפרדים אחד מהשני בשל מרכיבים שונים ותערובות במורד הזרם שלהם. mTORC1 מכיל חלבון רגולטורי הקשורים ייחודי של mTOR (בז), בעוד mTORC2 מכיל ובת לוויתו rapamycin-רגישות של mTOR (Rictor)9. mTORC1 ניתן לשלב ולשדר אותות חשוב לווסת צמיחת תאים, התפשטות ובידול. לאחרונה, להדגים שאת mTORC1 ממלא תפקיד מרכזי ברשת של ספיגת עצם קטבולי על-ידי מחיקה של Raptor בטל mTORC1 osteoclasts10. עם זאת, המנגנון הבסיסי דורש מחקר נוסף. במחקר הנוכחי, שיטה המבוססת על רנקל osteoclastogenic שימש לייצר osteoclasts הנגזרות מח עצם מקרופאגים (BMMs) של פראי-סוג (WT) ועכברים ראפCtsk , כדי לחקור את ההשפעה של איון mTORC1 על אוסטאוקלסט צורה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הבדיקה osteoclastogenic היא השיטה הנפוצה ביותר כדי לבודד את תרבות osteoclasts במבחנה12,13. בעוד מספר inductions מבוססי רנקל אוסטאוקלסט כבר מתואר13,14,15, המחקר הנוכחי תיאר פרוטוקול עם כמה שיפורים בהתבסס על השיטות הקודמות.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים טונג minghan ב ר ו ס קאטו על ריאגנטים מתן בחביבות ועכברים. אנו מודים חברי המעבדה Zou לדיונים שימושי. עבודה זו נתמך בחלקה על ידי מענקים מ- 973 תוכנית משרד המדע הסיני, טכנולוגיה (רובם) [2014CB964704, 2015CB964503], מחקר קליני, במגמה של 9 אנשים חולים, שנגחאי ג’יאו טונג הספר לרפואה של אוניברסיטת. תודה על העזרה של מתקן הליבה ביולוגיה של התא, מתקן הליבה עבור ביולוגיה כימית, CAS מרכז למצוינות מולקולרית תא המדע, שנגחאי מכון של ביוכימיה, ביולוגיה של התא, האקדמיה הסינית למדעים.
Materials
| Raptorfl/fl mice | The Jackson Laboratory | 013188 | |
| Ctsk-cre mice | a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan | ||
| α-MEM | Corning | 10-022-CVR | |
| Glutamine | Gibico | 25030081 | |
| Penicillin streptomycin | Gibico | 15140122 | |
| Fetal calf serum | BioInd | 04-001-1A | |
| Recombinant mouse M-CSF protein | R&D | Q3U4F9 | |
| Recombinant mouse RANKL protein | R&D | Q3TWY5 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | 302643 | |
| Acetone | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Citrate solution | Sigma-Aldrich | 915 | |
| Formaldehyde solution | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | |
| Fast Garnet GBC Base solution | Sigma-Aldrich | 3872 | |
| Sodium Nitrite Solution | Sigma-Aldrich | 914 | |
| Naphthol AS-BI Phosphate Solution | Sigma-Aldrich | 3871 | |
| Acetate solution | Sigma-Aldrich | 3863 | |
| Tartrate solution | Sigma-Aldrich | 3873 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning | 21-031-CVR | |
| L-tartaric acid | Sigma-Aldrich | 251380 | |
| Sodium tartrate dibasic dehydrate | Sigma-Aldrich | s4797 | |
| Glycine | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| MgCl2 | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| ZnCl2 | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| NaOH | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Phosphatase substrate | Sigma-Aldrich | P4744 | |
| anti-Raptor | Cell Signaling Technology | 2280 | |
| anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236) | Cell Signaling Technology | 2317 | |
| anti-ribosomal protein S6 | Cell Signaling Technology | 2211 | |
| anti-β-actin | Santa Cruz Biotechnology | sc-130300 | |
| 37% formaldehyde | Xilong scientific | ||
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane | Bio-Rad | ||
| Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Millipore | 00000367MSDS | |
| IX71 | Olympus | ||
| Envision | Perkin Elmer | ||
| 0.45-mm Syringe | |||
| Scissor | |||
| Mosquito forcep |
References
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).
- Feng, X., McDonald, J. M. Disorders of bone remodeling. Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).
- Boyce, B. F. Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts. J Bone Miner Res. 28 (4), 711-722 (2013).
- Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells. J Cell Biol. 99 (2), 471-480 (1984).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
- Wong, B. R., et al. TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells. J Biol Chem. 272 (40), 25190-25194 (1997).
- Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (1), 21-35 (2011).
- Bhaskar, P. T., Hay, N. The two TORCs and Akt. Dev Cell. 12 (4), 487-502 (2007).
- Dai, Q., et al. Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice. J Biol Chem. 292 (1), 196-204 (2017).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
- Tevlin, R., et al. Osteoclast derivation from mouse bone marrow. J Vis Exp. (93), e52056 (2014).
- Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells. Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).
- Hsu, H., et al. Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 3540-3545 (1999).
- Underwood, J. C. From where comes the osteoclast?. J Pathol. 144 (4), 225-226 (1984).
- Wein, M. N., et al. Control of bone resorption in mice by Schnurri-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8173-8178 (2012).
