माउस अस्थि मज्जा की एक RANKL आधारित अस्थिशोषक संस्कृति परख अस्थिशोषक गठन में mTORC1 की भूमिका की जांच करने के लिए
Summary
इस पांडुलिपि को अलग करने और माउस अस्थि मज्जा से इन विट्रो में संस्कृति osteoclasts के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है, और अस्थिशोषक गठन में rapamycin परिसर 1 के स्तनधारी/यंत्रवत लक्ष्य की भूमिका का अध्ययन ।
Abstract
Osteoclasts अद्वितीय अस्थि-resorbing कोशिकाओं है कि अस्थि मज्जा की monocyte/मैक्रोफेज वंश से अंतर कर रहे हैं । osteoclasts की शिथिलता हड्डी चयापचय रोगों, ऑस्टियोपोरोसिस सहित की एक श्रृंखला में परिणाम हो सकता है । रोग अस्थि जन हानि की रोकथाम के लिए दवा लक्ष्यों को विकसित करने के लिए, तंत्र जिसके द्वारा osteoclasts के अग्रदूतों से अंतर समझा जाना चाहिए । अलग करने की क्षमता और संस्कृति osteoclasts की एक बड़ी संख्या में इन विट्रो में महत्वपूर्ण है क्रम में अस्थिशोषक भेदभाव में विशिष्ट जीन की भूमिका निर्धारित करने के लिए । osteoclasts में rapamycin परिसर 1 (TORC1) के स्तनधारी/यंत्रवत लक्ष्य की निष्क्रियता अस्थिशोषक संख्या में कमी और अस्थि द्रव्यमान बढ़ा सकते हैं; हालांकि, अंतर्निहित तंत्र आगे अध्ययन की आवश्यकता है । वर्तमान अध्ययन में, एक RANKL आधारित प्रोटोकॉल और माउस अस्थि मज्जा से osteoclasts संस्कृति को अलग करने और अस्थिशोषक गठन पर mTORC1 निष्क्रियता के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए वर्णित है । इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक विशाल osteoclasts की एक बड़ी संख्या में परिणाम, आम तौर पर एक सप्ताह के भीतर । Raptor बिगड़ा अस्थिशोषक गठन के विलोपन और स्रावी tartrate-प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट की गतिविधि में कमी आई है, यह दर्शाता है कि mTORC1 अस्थिशोषक गठन के लिए महत्वपूर्ण है ।
Introduction
हड्डी एक कभी बदलते अंग है और जीवन भर osteoblasts और osteoclasts द्वारा remodeled है । Osteoclasts खनिज मैट्रिक्स याला और osteoblasts संश्लेषित और स्रावित नई हड्डी मैट्रिक्स के लिए जिंमेदार हैं1। अस्थि अवशोषण और अस्थि गठन के बीच संतुलन हड्डी के रखरखाव सहित अस्थि स्वास्थ्य के लिए महत्वपूर्ण है जन और उत्तेजना और चोट करने के लिए प्रतिक्रिया. यदि यह संतुलन बाधित है, अस्थि चयापचय रोगों की एक श्रृंखला, ऑस्टियोपोरोसिस और periodontal रोग सहित हो सकता है । इन रोगों में, osteoclastic हड्डी अवशोषण से उत्पन्न हड्डी द्रव्यमान हानि osteoblasts2,3की हड्डी बनाने की क्षमता से अधिक है । इस प्रकार, ताकि ऑस्टियोपोरोसिस जैसे कंकाल विकारों के इलाज के लिए दवा लक्ष्य विकसित करने के लिए, यह पीढ़ी और osteoclasts के जीव विज्ञान को समझने के लिए महत्वपूर्ण है4.
Osteoclasts पर या हड्डी की सतह के पास स्थित अद्वितीय विशाल multinucleated कोशिकाओं रहे हैं, और monocyte/मैक्रोफेज परिवार1के हैं । Ibbotson K. J. et al. 1, 25-dihydroxy-विटामिन डी 35युक्त माध्यम के साथ इन विट्रो में अस्थिशोषक-की तरह कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक विधि की सूचना दी । मैक्रोफेज की पहचान-कॉलोनी उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) और परमाणु कारक के लिए रिसेप्टर उत्प्रेरक-κ बी ligand (RANKL) अस्थिशोषक गठन के आवश्यक कारकों के रूप में नाटकीय रूप से osteoclastogenesis की क्षमता में वृद्धि हुई है इन विट्रो 1 , ६ , 7. इन विट्रो में कल्चर osteoclasts करने की क्षमता ने osteoclasts की जनरेशन और रेगुलेशन की हमारी समझ में सुधार किया है ।
स्तनधारी/यंत्रवत लक्ष्य rapamycin (mTOR) दो संरचनात्मक और कार्यात्मक विशिष्ट परिसरों में कार्य करता है, अर्थात् mTORC1 और mTORC28,9। दो बहु प्रोटीन परिसरों उनके विभिंन घटकों और बहाव सब्सट्रेट के कारण एक दूसरे से अलग हैं । mTORC1 में mTOR (Raptor) का अद्वितीय विनियामक-संबद्ध प्रोटीन होता है, जबकि mTORC2 में rapamycin (mTOR)9का Rictor-संवेदी साथी होता है । mTORC1 एकीकृत और महत्वपूर्ण संकेतों संचारित करने के लिए सेल विकास, प्रसार और भेदभाव को विनियमित कर सकते हैं । हाल ही में, हम का प्रदर्शन किया है कि mTORC1 के नेटवर्क में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है catabolic हड्डी याला के विलोपन के द्वारा Raptor को निष्क्रिय करने के लिए mTORC1 में osteoclasts10. हालांकि, अंतर्निहित तंत्र आगे अध्ययन की आवश्यकता है । वर्तमान अध्ययन में, एक RANKL आधारित osteoclastogenic विधि के लिए अस्थि मज्जा-व्युत्पंन मैक्रोफेज (BMMs) जंगली-प्रकार (WT) और रैपCtsk चूहों से osteoclasts उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और mTORC1 पर अस्थिशोषक निष्क्रियता के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए गठन.
Protocol
Representative Results
Discussion
osteoclastogenic परख को अलग करने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है और इन विट्रो12,13में संस्कृति osteoclasts । जबकि कई RANKL आधारित अस्थिशोषक प्रेरण13,14,15</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक Dr. Minghan टोंग और एस काटो के लिए कृपया एजेंट और चूहे प्रदान धंयवाद । हम उपयोगी विचार विमर्श के लिए Zou लैब के सदस्यों को धंयवाद । इस काम के हिस्से में विज्ञान और प्रौद्योगिकी के चीनी मंत्रालय से 973 कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (अधिकांश) [2014CB964704 और 2015CB964503], 9 पीपुल्स अस्पताल के नैदानिक अनुसंधान कार्यक्रम, शंघाई Jiao टोंग विश्वविद्यालय चिकित्सा के स्कूल । सेल जीवविज्ञान और रासायनिक जीवविज्ञान के लिए कोर सुविधा के लिए कोर सुविधा की मदद के लिए धन्यवाद, कैस आणविक कोशिका विज्ञान में उत्कृष्टता के लिए केंद्र, जैव रसायन और सेल बायोलॉजी के शंघाई संस्थान, चीनी विज्ञान अकादमी.
Materials
| Raptorfl/fl mice | The Jackson Laboratory | 013188 | |
| Ctsk-cre mice | a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan | ||
| α-MEM | Corning | 10-022-CVR | |
| Glutamine | Gibico | 25030081 | |
| Penicillin streptomycin | Gibico | 15140122 | |
| Fetal calf serum | BioInd | 04-001-1A | |
| Recombinant mouse M-CSF protein | R&D | Q3U4F9 | |
| Recombinant mouse RANKL protein | R&D | Q3TWY5 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | 302643 | |
| Acetone | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Citrate solution | Sigma-Aldrich | 915 | |
| Formaldehyde solution | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | |
| Fast Garnet GBC Base solution | Sigma-Aldrich | 3872 | |
| Sodium Nitrite Solution | Sigma-Aldrich | 914 | |
| Naphthol AS-BI Phosphate Solution | Sigma-Aldrich | 3871 | |
| Acetate solution | Sigma-Aldrich | 3863 | |
| Tartrate solution | Sigma-Aldrich | 3873 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning | 21-031-CVR | |
| L-tartaric acid | Sigma-Aldrich | 251380 | |
| Sodium tartrate dibasic dehydrate | Sigma-Aldrich | s4797 | |
| Glycine | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| MgCl2 | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| ZnCl2 | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| NaOH | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Phosphatase substrate | Sigma-Aldrich | P4744 | |
| anti-Raptor | Cell Signaling Technology | 2280 | |
| anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236) | Cell Signaling Technology | 2317 | |
| anti-ribosomal protein S6 | Cell Signaling Technology | 2211 | |
| anti-β-actin | Santa Cruz Biotechnology | sc-130300 | |
| 37% formaldehyde | Xilong scientific | ||
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane | Bio-Rad | ||
| Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Millipore | 00000367MSDS | |
| IX71 | Olympus | ||
| Envision | Perkin Elmer | ||
| 0.45-mm Syringe | |||
| Scissor | |||
| Mosquito forcep |
References
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