التنميط البروتين العميق بوسم إيسوباريك وواسعة النطاق اللوني السائل والطيف الكتلي وساعدت برامج القياس الكمي
Summary
نقدم بروتوكولا لدقة قوانتيتاتي البروتينات مع وسمها isobaric، وتجزئة واسعة النطاق، والأدوات المعلوماتية الحيوية وخطوات مراقبة الجودة في تركيبة مع اللوني السائل موصول إلى مطياف كتلة ذات الدقة عالية.
Abstract
قد بذلت العديد من أوجه التقدم الاستثنائي في الطيف الكتلي (مللي ثانية)-على أساس البروتيوميات، مع التقدم التقني خاصة في اللوني السائل (ش) بالإضافة إلى الترادف الطيف الكتلي (LC-MS/MS) والقدرات المتنوعة وضع العلامات إيسوباريك. وهنا، نقدم بروتوكول تنميط البروتيوميات عميق الذي يجمع بين 10-من نوع plex جنبا إلى جنب الشامل العلامة (TMT) وسم مع منصة LC/LC-MS/MS واسعة النطاق، وتصحيح مللي ثانية بعد انتهاء التدخل الحسابية دقة قوانتيتاتي بروتيوميس كله. هذا البروتوكول يشمل الخطوات الرئيسية التالية: استخراج البروتين والهضم ووسم الحديد، ثنائي الأبعاد (2D) LC، الكتلي عالية الاستبانة، وتجهيز البيانات الحسابية. يتم تضمين لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها وتقييم التباين التجريبية خطوات مراقبة الجودة. يمكن أن يكون كوانتيتاتيد 10,000 أكثر من البروتينات في عينات الثدييات ثقة مع هذا البروتوكول. يمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول على كوانتيتاتيون التعديلات بعد متعدية مع تغييرات طفيفة. يوفر هذا الأسلوب متعدد وقوية هي أداة قوية لتحليل البروتين في مجموعة متنوعة من النماذج المعقدة، بما في ذلك زراعة الخلايا والأنسجة الحيوانية، والعينات السريرية البشرية.
Introduction
التقدم في تكنولوجيا الجيل التالي تسلسل أدت إلى المشهد جديد لدراسة النظم البيولوجية والأمراض التي تصيب البشر. وقد أتاح هذا عدد كبير من القياسات للجينوم والترنسكربيتوم والبروتين، ميتابولومي، ونظم أخرى الجزيئية لتصبح ملموسة. الطيف الكتلي (MS) أحد الأساليب الأكثر حساسية في الكيمياء التحليلية، وتطبيقه في البروتيوميات وقد توسعت بسرعة بعد تسلسل الجينوم البشري. في ميدان البروتيوميات، السنوات القليلة الماضية قد أسفرت عن أوجه التقدم التقني الرئيسية في التحليلات الكمية على أساس مرض التصلب العصبي المتعدد، بما في ذلك العلامات إيسوباريك ومضاعفة القدرة جنبا إلى جنب مع واسعة النطاق اللوني السائل، بالإضافة إلى الأجهزة السلف، مما يسمح لقياسات أكثر دقة، وأسرع مع أقل مواد العينة المطلوبة. البروتيوميات الكمية أصبحت نهجاً التيار الرئيسي للتنميط عشرات الآلاف من البروتينات والتعديلات بوستترانسلاشونال في عينات بيولوجية معقدة للغاية1،2،،من34 , 5 , 6.
متعدد أساليب وصفها isobaric مثل العلامة إيسوباريك كوانتيتاتيون النسبية والمطلقة (أي، إيتراق) والعلامة الجماعية جنبا إلى جنب (TMT) مرض التصلب العصبي المتعدد إلى حد كبير تحسنت إنتاجية عينة وازداد عدد العينات التي يمكن تحليلها في واحد تجربة1،6،،من78. جنبا إلى جنب مع الأساليب الأخرى المستندة إلى MS كوانتيتيشن، مثل كوانتيتيشن خالية من التسمية والنظائر المستقرة وسم مع الأحماض الأمينية في الخلية والثقافة (أيسيلك)، إمكانيات هذه التقنيات في البروتيوميات هو ميدان كبير9 ،،من1011. على سبيل المثال، يسمح الأسلوب الحديد 10 البروتين عينات تحليلها معا في التجربة 1 باستخدام الكواشف 10-من نوع plex. هذه العلامات الحديد هيكلياً متطابقة الجماهيري العام نفسه، ولكن النظائر الثقيلة توزع الأثران على ذرات الكربون أو النيتروجين، أسفر عن أيون مراسل فريدة من نوعها خلال تجزئة MS/MS لكل علامة، وبالتالي تمكين كوانتيتاتيون النسبية بين العينات العشر. تطبيق هذه الاستراتيجية الحديد بشكل روتيني لدراسة الممرات البيولوجية وتطور المرض والعمليات الخلوية12،،من1314.
تحسينات تقنية كبيرة عززت النظم – MS/MS اللوني السائل (ش)، سواء من حيث فصل LC والمعلمات مرض التصلب العصبي المتعدد، إلى أقصى حد ممكن تحديد البروتين دون التضحية بدقة كوانتيتيشن. فصل البعد الأول من الببتيدات بأسلوب فصل مع تعامد عالية للبعد الثاني ضروري في هذا النوع من الأسلوب البروتيوميات بندقية لتحقيق أقصى قدر من النتائج20. درجة الحموضة عالية عكس المرحلة اللوني السائل (ربلك) يوفر أداء أفضل مما يفعل تبادل الأيونات الموجبة القوى التقليدية اللوني20. عندما يتم الجمع بين ربلك درجة الحموضة العالية ذات بعد ثاني من ربلك درجة الحموضة المنخفضة، التحليل الديناميكي وتغطية البروتين يتم تحسين، أسفر عن القدرة على تحديد الجزء الأكبر البروتينات المعرب عنها عند إجراء تحليلات البروتين كل15 ،16،،من1718. التطورات التقنية الأخرى تشمل C18 جزيئات صغيرة (1.9 ميكرومتر) وتمديد فترة طويلة العمود (~ 1 م)19. وعلاوة على ذلك، تتضمن التحسينات الملحوظة الأخرى الإصدارات الجديدة من المطيافات الشامل مع معدلات المسح السريع وتحسين حساسية والقرار20وأنابيب المعلوماتية المتطورة لمرض التصلب العصبي المتعدد البيانات التعدين21.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصلة تتضمن المنهجيات الأخيرة مع بعض التعديلات لتحسين حساسية والإنتاجية، مع التركيز على آليات لمراقبة الجودة في جميع أنحاء هذه التجربة. ويتضمن البروتوكول استخراج البروتين والهضم والحديد 10-من نوع plex وسم والأس الهيدروجيني القاعدي وتجزئة ربلك حامضي، الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد عالية الاستبانة وتجهيز البيانات MS (الشكل 1). وعلاوة على ذلك، علينا أن ننفذ عدة خطوات مراقبة الجودة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها وتقييم التباين التجريبية. هذا البروتوكول مفصلاً يهدف إلى مساعدة الباحثين جديدة إلى الميدان بشكل روتيني تحديد ودقة كوانتيتاتي آلاف بروتينات من أو الأنسجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكننا وصف بروتوكول الفائق كوانتيتيشن البروتينات مع استراتيجية التوسيم isobaric 10-من نوع plex، التي نفذت بنجاح في عدة منشورات12،،من1314،32 . في هذا البروتوكول، يمكننا تحليل عينات البروتين البيولوجي مختلفة تصل إلى 10 في التجربة 1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون سائر أعضاء المختبر ومرفق لمناقشة مفيدة. هذا العمل كان تدعمها جزئيا منح ح ني R01GM114260، R01AG047928، R01AG053987، والساك. تم إجراء تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد في الأطفال سانت جود “مستشفى البروتيوميات منشأة الأبحاث”، معتمدة بشكل جزئي بمنحه “دعم مركز السرطان المعاهد الوطنية للصحة” P30CA021765. يشكر المؤلفون نيشا باديرس للمساعدة في تحرير المخطوطة.
Materials
| 1220 LC system | Agilent | G4288B | |
| 50% Hydroxylamine | Thermo Scientific | 90115 | |
| Acetonitrile | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BB24-AU | |
| Butterfly Portfolio Heater | Phoenix S&T | PST-BPH-20 | |
| C18 tips | Harvard Apparatus | 74-4607 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 | |
| DMSO | Sigma | 41648 | |
| Formic acid | Sigma | 94318 | |
| Fraction Collector | Gilson | FC203B | |
| Glass Beads | Next Advance | GB05 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I6125 | |
| Lys-C | Wako | 125-05061 | |
| Methanol | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive HF | |
| nanoflow UPLC | Thermo Scientific | Ultimate 3000 | |
| ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um | Dr. Maisch GmbH | r119.aq.0003 | |
| Self Pck Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Speedva | Thermo Scientific | SPD11V | |
| TMT 10plex Isobaric label reagent | Thermo Scientific | 90110 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Applied Biosystems | 400003 | |
| Trypsin | Promega | V511C | |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Xbridge Column C18 column | Waters | 186003943 | |
| Ziptips C18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| SepPak 1cc 50mg | Waters | WAT054960 |
References
- Pagala, V. R., et al. Quantitative protein analysis by mass spectrometry. Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).
- Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14 (1), 35-48 (2013).
- Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Bai, B., et al. Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling. Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Anal Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run. Anal Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Bai, B., et al. Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer’s disease. J Proteome Res. 13 (11), 4526-4534 (2014).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. Recent advances of proteomics applied to human diseases. J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).
- Churchman, M. L., et al. Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancer Cell. 28 (3), 343-356 (2015).
- Wang, X., et al. Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk. Nat Commun. 7, 10464 (2016).
- Mertz, J. L., et al. Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth. Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Wang, H., et al. An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Song, C., et al. Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides. Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).
- Wang, H., et al. Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome. J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).
- Hebert, A. S., et al. The one hour yeast proteome. Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).
- Wang, X., et al. JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).
- Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
- Niu, M., et al. Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry. Anal Chem. 89 (5), 2956-2963 (2017).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
- Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
- Wenger, C. D., et al. Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging. Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).
- McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes. Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
- Zhou, F., et al. Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry. Nat Commun. 4, 2171 (2013).
- Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
- Ahrne, E., et al. Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments. J Proteome Res. 15 (8), 2537-2547 (2016).
- Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
- Tan, H., et al. Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation. Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).
- Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells. Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).
- Tan, H., et al. Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome. Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).
- Li, Y., et al. JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells. J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).
- Yuan, Y., et al. Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types. Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).
- Nesvizhskii, A. I. Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies. Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).
- Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).
