定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング
Summary
正確に高分解能質量分析計を接続した液体クロマトグラフィーによる定圧ラベリング、広範な分別、バイオインフォマティクス ツールの組み合わせで品質管理手順と蛋白質を量的にプロトコルを提案します。
Abstract
多くの例外的な進歩は、質量分析法 (MS) で行われている-基づくプロテオミクス、液体クロマトグラフィー (LC) における特定の技術進歩とタンデム質量分析法 (MS/LCMS) と定圧ラベル多重能力に結合します。広範な LC/クロマトグラフィー-タンデム質量プラットフォームと正確に全体のプロテオームを量的に後 MS 計算干渉補正 10 プレックス タンデム質量タグ (TMT) ラベルを組み合わせた深いプロテオミクス プロファイリング プロトコルを紹介します。このプロトコルには、次の主要な手順が含まれています: 蛋白質の抽出と消化、TMT がラベル付け、2 次元 (2 D) LC、高分解能の質量分析法および計算のデータ処理。品質管理手順、トラブルシューティングおよび実験の変化を評価するため含まれています。哺乳類の試料中の 10,000 以上のタンパク質は、このプロトコルで自信を持って測定することができます。このプロトコルは、軽微な変更と翻訳後修飾の定量にも適用できます。この多重化、堅牢なメソッドは、さまざまな複雑なサンプル、培養細胞、動物組織、ひと臨床検体などのプロテオーム解析のための強力なツールを提供します。
Introduction
次世代シーケンシング技術の進歩は、生物学的システムおよび人間の病気を研究するための新しい風景につながっています。これは、ゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム、メタボローム、具体的になって他の分子システムの測定の数が多いを許可しています。質量分析法 (MS) 分析化学における最も敏感な方法の 1 つで、プロテオミクスの応用は人間のゲノムの配列の後急速に拡大しています。過去数年間プロテオミクス分野で MS ベースの定量的分析を定圧ラベリングと計測に加え、豊富な液体クロマトグラフィーと結合機能を多重化などを含む主要な技術の進歩が得られています。進歩より速くより正確な測定のために必要な以下の試料を可能にします。定量的プロテオミクス蛋白質と非常に複雑な生体試料1,2,3,4の翻訳後修飾の数万人をプロファイリングのアプローチが主流となっています。,5,6。
相対パスと絶対定量 (すなわちiTRAQ) とタンデム質量タグ (TMT) MS の定圧タグなど多重の定圧ラベル表示方法が大きくサンプル スループット向上し、単一で分析できるサンプルの数を増加1,6,7、8を試してみてください。ラベル無料定量など安定同位体標識細胞培養 (すなわちSILAC)、アミノ酸、プロテオミクス、これらのテクニックの可能性と共に他の MS に基づく定量方法もかなり9 フィールドが、10,11。たとえば、TMT メソッドは 1 実験で 10 プレックス試薬を使用して一緒に分析されるべき 10 の蛋白質のサンプルを許可します。これらの構造的に同じ TMT タグ同じ全体の質量が重い同位体がフラグメンテーション相対定量が可能となる、各タグの中にユニークなレポーター イオンで生じる炭素または窒素原子の分布の比較間 10 のサンプルします。TMT 戦略は日常的に生物学的経路、病気の進行、細胞プロセス12,13,14の研究に適用されます。
相当な技術的な改善は、液体クロマトグラフィー (LC)-MS/MS システム、LC 分離と定量精度を損なうことがなく、タンパク質の同定を最大化するために、MS パラメーターの両面を強化します。結果の最大数20を達成するために散弾銃プロテオミクス手法のこのタイプの最初の次元に 2 番目の次元の高い直交性と分離法によるペプチドの分離が欠かせません。高 pH 逆相液体クロマトグラフィー (市販清涼飲料水) は、従来の強陽イオン交換クロマトグラフィー20よりもパフォーマンスが向上を提供します。全体プロテオーム解析15 を実行するときに表現された蛋白質の大部分を識別できるようになります分析ダイナミック レンジとタンパク質報道が改善されるように、pH が高い市販清涼飲料水を低 pH 市販清涼飲料水の 2 番目の次元と組み合わせれば、、16,17,18。その他の技術の進歩は C18 微粒子 (1.9 μ m) を含めるし、長い列 (~ 1 m)19を拡張します。さらに、他の顕著な改善には、急速なスキャン速度、感度の向上と解像度20、MS データ マイニング21の高度なバイオインフォマティクス パイプラインと質量分析計の新しいバージョンが含まれます。
ここでは、実験を通して品質管理機構に焦点を当てながら感度とスループットを向上させるための変更を最も最近の方法論を取り入れた詳細なプロトコルについて述べる。プロトコルには、蛋白質の抽出と消化、TMT 10 プレックス ラベリング、基本的な pH と酸性 pH 市販清涼飲料水分別、高分解能 MS 検出、および MS データ加工 (図 1) が含まれます。また、トラブルシューティングおよび実験の変化を評価するためのいくつかの品質管理手順を実施します。この詳細なプロトコルは、研究者を助ける新しいフィールドに日常的に識別し、正確にたくさんの lysate からの蛋白質を量的に使用または組織。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々 は、いくつかの出版物12,13,14,32 で正常に実装されている 10-プレックス定圧ラベリング戦略が付いている蛋白質の定量のための高スループット プロトコルを記述します。.このプロトコルでは 1 の実験では最大 10 の異なる生物蛋白質のサンプルを分析できます。日常的に識別でき信頼性の高?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、役に立つ議論のためにすべての他の研究室、施設メンバーをありがとうございます。この仕事は部分的に支えられた R01GM114260、R01AG047928、R01AG053987、ALSAC NI H を付与します。聖ジュード小児研究病院プロテオミクス施設で、NIH がんセンター助成金 P30CA021765 で部分的にサポートされている MS 解析を行った。著者はニサ Badders の原稿を編集のヘルプをありがちましょう。
Materials
| 1220 LC system | Agilent | G4288B | |
| 50% Hydroxylamine | Thermo Scientific | 90115 | |
| Acetonitrile | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BB24-AU | |
| Butterfly Portfolio Heater | Phoenix S&T | PST-BPH-20 | |
| C18 tips | Harvard Apparatus | 74-4607 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 | |
| DMSO | Sigma | 41648 | |
| Formic acid | Sigma | 94318 | |
| Fraction Collector | Gilson | FC203B | |
| Glass Beads | Next Advance | GB05 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I6125 | |
| Lys-C | Wako | 125-05061 | |
| Methanol | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive HF | |
| nanoflow UPLC | Thermo Scientific | Ultimate 3000 | |
| ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um | Dr. Maisch GmbH | r119.aq.0003 | |
| Self Pck Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Speedva | Thermo Scientific | SPD11V | |
| TMT 10plex Isobaric label reagent | Thermo Scientific | 90110 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Applied Biosystems | 400003 | |
| Trypsin | Promega | V511C | |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Xbridge Column C18 column | Waters | 186003943 | |
| Ziptips C18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| SepPak 1cc 50mg | Waters | WAT054960 |
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