Глубокая протеома профилирование Изобарический маркировки, обширные жидкостная хроматография, масс-спектрометрии и при содействии программного обеспечения количественной оценки
Summary
Мы представляем протокол к точно quantitate белки с Изобарический маркировки, обширные фракционирования, Биоинформатика инструменты и меры контроля качества в сочетании с жидкостной хроматографии, сопряжена с высоким разрешением масс-спектрометр.
Abstract
Многие исключительные успехи в масс-спектрометрия (МС)-на основе протеомики, с конкретного технического прогресса в жидкостной хроматографии (LC) в сочетании с тандем масс-спектрометрия (LC-MS/MS) и изобарических маркировки мультиплексирования потенциала. Здесь мы представляем глубоко протеомики профилирования протокол, который сочетает в себе 10-plex тандем массового тег (ТМТ) маркировки с обширной платформой LC/LC-MS/MS и исправление после МС вычислительной вмешательства точно quantitate весь протеомов. Этот протокол включает следующие основные шаги: белка добычу и пищеварение, TMT маркировки, двухмерный (2D) LC, с высоким разрешением масс-спектрометрии и вычислительной обработки данных. Контроль качества шаги включены для диагностики и оценки экспериментальной вариации. Более чем 10 000 белки в млекопитающих образцы можно уверенно предел с настоящим Протоколом. Этот протокол также может быть применен к количественный столб-поступательные изменения с незначительными изменениями. Этот мультиплексированных, надежный метод предоставляет мощный инструмент для протеомного анализа в различных сложных проб, включая культуру клеток, тканей животных и человека клинических образцов.
Introduction
Достижения в технологии секвенирование нового поколения привели к новый ландшафт для изучения биологических систем и болезни человека. Это позволило большое количество измерений генома, транскриптом, протеом, метаболом и других молекулярных систем станет ощутимым. Масс-спектрометрия (МС) является одним из наиболее чувствительных методов в аналитической химии, и его применение в протеомике быстро расширилась после секвенирования генома человека. В области протеомики за последние несколько лет были достигнуты крупные технические достижения в основе MS количественного анализа, включая Изобарический маркировки и мультиплексирования возможности в сочетании с обширной жидкостной хроматографии, помимо инструментария авансы, позволяя быстрее, более точные измерения с меньше материала образца требуется. Количественные протеомике стали основной подход для профилирования десятки тысяч белков и Посттрансляционная модификаций в весьма сложных биологических образцов1,2,3,4 , 5 , 6.
Мультиплексированных Изобарический обозначая методы, такие как Изобарический тег для относительной и абсолютной количественный (например, iTRAQ) и тандем массового тег (ТМТ) MS значительно улучшили образца пропускной способности и увеличил количество образцов, которые могут быть проанализированы в отдельном эксперимент1,6,,78. Наряду с другими на основе MS количественный методы например метка бесплатно количественный и стабильных изотопов, маркировки с аминокислоты в культуре клеток (например, SILAC), потенциал этих методов протеомики поле является значительным9 ,10,11. Например метод ТМТ позволяет 10 образцы протеина, чтобы быть проанализированы вместе в 1 эксперимент с использованием 10-plex реагентов. Эти структурно идентичны TMT теги имеют той же общей массы, но тяжелые изотопы распределяются дифференцировано на атомы углерода и азота, обусловило уникальный репортер Ион во время МС/МС фрагментации каждого тега, тем самым позволяя относительной количественный между 10 образцов. TMT стратегия обычно применяется для изучения биологических пути, прогрессирования заболевания и клеточных процессов12,,1314.
Значительные технические усовершенствования улучшили жидкостной хроматографии (LC)-MS/MS систем, как с точки зрения LC цветоделение и MS параметры, чтобы максимизировать идентификации белок без ущерба для точности количественный. Разделение первом измерении пептидов путем разделения технику с высоким ортогональности для второго измерения имеет решающее значение в этом типе метода протеомики ружье для достижения максимальных результатов20. Высоком рН обратная фаза жидкостной хроматографии (RPLC) обеспечивает лучшую производительность, чем обычных сильных катионообмен хроматографии20. При высоком рН RPLC сочетается с второго измерения низкого pH RPLC, аналитический динамический диапазон и белка охват улучшаются, результате способность определить основную часть выраженных белков при выполнении всего протеома анализы15 ,16,17,18. Другие технические достижения включают в себя мелкие частицы C18 (1.9 мкм) и продлил длинный столбец (~ 1 м)19. Кроме того другие заметные улучшения включают в себя новые версии масс-спектрометров с быстрого сканирования ставки, улучшена чувствительность и резолюции20и сложные биоинформатики трубопроводов для интеллектуального анализа данных MS21.
Здесь мы описываем подробный протокол, который включает в себя самые последние методики с изменениями для повышения чувствительности и пропускную способность, сосредоточив внимание на механизмы контроля качества на протяжении всего эксперимента. Протокол включает извлечения белков и пищеварение, TMT 10-plex маркировки, базовых pH и рН RPLC фракционирования, с высоким разрешением MS обнаружения и обработки данных MS (рис. 1). Кроме того мы осуществляем несколько этапов контроля качества для диагностики и оценки экспериментальной вариации. Этот подробный протокол призван помочь исследователям новые на местах регулярно выявлять и точно quantitate тысячи белков от lysate или ткани.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описываем высок объём протокол для количественный белков с 10-plex Изобарический маркировки стратегию, которая была успешно внедрена в ряде публикаций12,13,14,32 . В этом протоколе мы можем анализировать до 10 различных б?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят всех других членов лаборатории и учреждения для полезной дискуссии. Эта работа частично была поддержана NI H предоставляет R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 и ALSAC. Был проведен анализ MS в St. Jude Children’s исследований больницы протеомики, поддерживаемый, частично гранта NIH рака центр поддержки P30CA021765. Авторы благодарят Nisha Badders за помощь в редактировании рукопись.
Materials
| 1220 LC system | Agilent | G4288B | |
| 50% Hydroxylamine | Thermo Scientific | 90115 | |
| Acetonitrile | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BB24-AU | |
| Butterfly Portfolio Heater | Phoenix S&T | PST-BPH-20 | |
| C18 tips | Harvard Apparatus | 74-4607 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 | |
| DMSO | Sigma | 41648 | |
| Formic acid | Sigma | 94318 | |
| Fraction Collector | Gilson | FC203B | |
| Glass Beads | Next Advance | GB05 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I6125 | |
| Lys-C | Wako | 125-05061 | |
| Methanol | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive HF | |
| nanoflow UPLC | Thermo Scientific | Ultimate 3000 | |
| ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um | Dr. Maisch GmbH | r119.aq.0003 | |
| Self Pck Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Speedva | Thermo Scientific | SPD11V | |
| TMT 10plex Isobaric label reagent | Thermo Scientific | 90110 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Applied Biosystems | 400003 | |
| Trypsin | Promega | V511C | |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Xbridge Column C18 column | Waters | 186003943 | |
| Ziptips C18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| SepPak 1cc 50mg | Waters | WAT054960 |
References
- Pagala, V. R., et al. Quantitative protein analysis by mass spectrometry. Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).
- Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14 (1), 35-48 (2013).
- Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Bai, B., et al. Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling. Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Anal Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run. Anal Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Bai, B., et al. Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer’s disease. J Proteome Res. 13 (11), 4526-4534 (2014).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. Recent advances of proteomics applied to human diseases. J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).
- Churchman, M. L., et al. Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancer Cell. 28 (3), 343-356 (2015).
- Wang, X., et al. Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk. Nat Commun. 7, 10464 (2016).
- Mertz, J. L., et al. Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth. Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Wang, H., et al. An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Song, C., et al. Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides. Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).
- Wang, H., et al. Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome. J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).
- Hebert, A. S., et al. The one hour yeast proteome. Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).
- Wang, X., et al. JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).
- Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
- Niu, M., et al. Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry. Anal Chem. 89 (5), 2956-2963 (2017).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
- Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
- Wenger, C. D., et al. Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging. Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).
- McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes. Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
- Zhou, F., et al. Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry. Nat Commun. 4, 2171 (2013).
- Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
- Ahrne, E., et al. Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments. J Proteome Res. 15 (8), 2537-2547 (2016).
- Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
- Tan, H., et al. Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation. Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).
- Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells. Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).
- Tan, H., et al. Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome. Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).
- Li, Y., et al. JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells. J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).
- Yuan, Y., et al. Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types. Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).
- Nesvizhskii, A. I. Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies. Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).
- Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).
