Proteoma profundo perfiles de etiquetado isobárico, extenso de la cromatografía líquida, espectrometría de masas y asistida por el Software de cuantificación
Summary
Presentamos un protocolo para cuantificar con precisión las proteínas con etiquetado isobárico, fraccionamiento extensa, herramientas bioinformáticas y pasos de control de calidad en combinación con interfaz a un espectrómetro de masas de alta resolución de la cromatografía líquida.
Abstract
Se han logrado muchos avances excepcionales en espectrometría de masas (MS)-basado en proteómica, con progreso técnico especial en cromatografía líquida (LC) acoplada a la espectrometría total en tándem (LC-MS/MS) y la capacidad de multiplexación etiquetado isobárico. Aquí, presentamos un protocolo perfilado profundo-proteómica que combina 10-plex etiqueta masa tándem (TMT) etiquetado con una amplia plataforma LC/LC-MS/MS y corrección de interferencias computacional MS post para cuantificar con precisión todo proteomas. Este protocolo incluye los siguientes pasos principales: extracción de proteínas y la digestión, etiquetado TMT, 2 dimensiones (2D) LC, espectrometría de masas de alta resolución y procesamiento computacional de datos. Medidas de control de calidad se incluyen para solucionar problemas y evaluar la variación experimental. Más de 10.000 proteínas en muestras de mamíferas pueden cuantificarse con confianza con este protocolo. Este protocolo se puede aplicar también a la cuantificación de modificación post traduccional con cambios menores. Este método multiplexado, robusto proporciona una poderosa herramienta para análisis proteómico en una variedad de muestras complejas, incluyendo cultivo de células, tejidos animales y especímenes clínicos humanos.
Introduction
Avances en la tecnología de secuenciación de última generación han llevado a un nuevo panorama para el estudio de sistemas biológicos y enfermedad humana. Esto ha permitido un gran número de mediciones de genoma, transcriptoma, proteoma, metaboloma y otros sistemas moleculares a ser tangible. Espectrometría de masas (MS) es uno de los más sensibles métodos de química analítica y su aplicación en proteómica ha ampliado rápidamente después de la secuenciación del genoma humano. En el campo de la proteómica, los últimos años han producido importantes avances en los análisis cuantitativos basados en MS, incluyendo etiquetado isobárico y la multiplexación capacidad combinada con cromatografía líquida extensa, además de instrumentación avanza, lo que permite mediciones más rápidas, más precisas con menos material de muestra requerido. Proteómica cuantitativa se ha convertido en un enfoque convencional para perfiles de decenas de miles de proteínas y modificaciones postraduccionales en muestras biológicas altamente complejas1,2,3,4 , 5 , 6.
Multiplexados métodos Etiquetadoras isobáricos isobáricos etiqueta para cuantificación absoluta y relativa (es decir, iTRAQ) y etiqueta de masa tándem (TMT) MS grandemente mejorado rendimiento de muestra y aumentó el número de muestras que pueden analizarse en un solo experimento1,6,7,8. Junto con otros métodos de cuantificación basado en MS, cuantificación de etiqueta-libre como el isótopo estable que etiqueta con aminoácidos en cultura de célula (es decir, SILAC), el potencial de estas técnicas en la proteómica campo es considerable9 ,10,11. Por ejemplo, el método TMT permite 10 muestras de proteínas a analizar juntos en 1 experimento utilizando reactivos 10-plex. Estas etiquetas TMT estructuralmente idénticas tienen la misma masa global, pero los isótopos pesados se distribuyen diferencialmente en átomos de carbono o nitrógeno, resultando en un ión único reportero durante fragmentación de MS/MS de cada etiqueta, permitiendo la cuantificación relativa entre las 10 muestras. La estrategia TMT se aplica rutinariamente para estudiar vías biológicas, progresión de la enfermedad y los procesos celulares12,13,14.
Sustanciales mejoras técnicas han mejorado los sistemas de cromatografía líquida (LC)-MS/MS, tanto en términos de parámetros de MS, para maximizar la identificación de proteínas sin sacrificar la precisión de la cuantificación y separaciones LC. Primera dimensión separación de péptidos mediante una técnica de separación con alta ortogonalidad a la segunda dimensión es fundamental en este tipo de método de Proteómica de escopeta para lograr máximos resultados20. Cromatografía líquida de fase inversa de alto pH (RPLC) proporciona un mejor rendimiento que hace de la cromatografía de intercambio catiónico fuerte convencional20. Cuando RPLC de alto pH se combina con una segunda dimensión de TAGATOSA bajo pH, rango dinámico análisis y cobertura de proteína se mejoran, dando por resultado la capacidad para identificar la mayor parte de las proteínas expresadas al realizar análisis de proteoma conjunto15 ,16,17,18. Otros avances incluyen pequeñas partículas de C18 (1,9 μm) y extendido largo columna (~ 1 m)19. Además, otras mejoras notables incluyen nuevas versiones de espectrómetros de masas con las tasas de exploración rápida, mejoras en la sensibilidad y resolución20y sofisticada bioinformática tuberías para MS datos minería21.
Aquí, describimos un protocolo detallado que incorpora las más recientes metodologías con modificaciones para mejorar la sensibilidad y rendimiento, mientras se centra en los mecanismos de control de calidad durante todo el experimento. El protocolo incluye la extracción de proteínas y la digestión, TMT 10-plex etiquetado, pH básico y pH ácido RPLC fraccionamiento, detección MS alta resolución y procesamiento de datos de MS (figura 1). Además, implementamos varios pasos de control de calidad para solucionar problemas y evaluar la variación experimental. Este protocolo detallado está destinada a nuevos investigadores en el campo habitualmente identificar y cuantificar con precisión miles de proteínas a partir de un lisado o tejido.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se describe un protocolo de alto rendimiento para la cuantificación de proteínas con una estrategia etiquetado isobárico 10-plex, que se ha aplicado con éxito en varias publicaciones12,13,14,32 . En este protocolo, podemos analizar hasta 10 muestras diferentes de proteínas biológicas en el 1 experimento. Habitualmente podemos identificar y cuantificar proteínas más 10.000 con alta confi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a todos los demás miembros laboratorio y centro de debate útil. Este trabajo fue parcialmente apoyado por H NI otorga ALSAC, R01GM114260, R01AG047928 y R01AG053987. Se realizó el análisis de MS en de St. Jude Children Research Hospital proteómica, parcialmente financiado por subvenciones de NIH centro apoyo P30CA021765. Los autores agradecen a Nisha Badders ayuda con editar el manuscrito.
Materials
| 1220 LC system | Agilent | G4288B | |
| 50% Hydroxylamine | Thermo Scientific | 90115 | |
| Acetonitrile | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BB24-AU | |
| Butterfly Portfolio Heater | Phoenix S&T | PST-BPH-20 | |
| C18 tips | Harvard Apparatus | 74-4607 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 | |
| DMSO | Sigma | 41648 | |
| Formic acid | Sigma | 94318 | |
| Fraction Collector | Gilson | FC203B | |
| Glass Beads | Next Advance | GB05 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I6125 | |
| Lys-C | Wako | 125-05061 | |
| Methanol | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive HF | |
| nanoflow UPLC | Thermo Scientific | Ultimate 3000 | |
| ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um | Dr. Maisch GmbH | r119.aq.0003 | |
| Self Pck Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Speedva | Thermo Scientific | SPD11V | |
| TMT 10plex Isobaric label reagent | Thermo Scientific | 90110 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Applied Biosystems | 400003 | |
| Trypsin | Promega | V511C | |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Xbridge Column C18 column | Waters | 186003943 | |
| Ziptips C18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| SepPak 1cc 50mg | Waters | WAT054960 |
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