Isobaric लेबलिंग, व्यापक तरल क्रोमैटोग्राफी, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, और सॉफ्टवेयर असिस्टेड ठहराव द्वारा डीप Proteome profile
Summary
हम सही isobaric लेबलिंग, व्यापक भिन्नीकरण, bioinformatics उपकरण, और एक उच्च संकल्प जन स्पेक्ट्रोमीटर के लिए इंटरफेस के साथ संयोजन में गुणवत्ता नियंत्रण कदम के साथ प्रोटीन quantitate करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं ।
Abstract
कई असाधारण अग्रिमों में किया गया है मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ms)-आधारित प्रोटियोमिक्, में विशेष तकनीकी प्रगति के साथ तरल क्रोमैटोग्राफी (lc) मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री करने के लिए युग्मित (नियंत्रण रेखा एमएस/ms) और isobaric लेबलिंग division क्षमता. यहां, हम एक गहन प्रोटियोमिक् रूपरेखा प्रोटोकॉल है कि 10-plex मिलकर जन टैग (टीएमटी) एक व्यापक नियंत्रण रेखा के साथ लेबलिंग/एमएस/एमएस मंच, और पोस्ट-एमएस अभिकलनी हस्तक्षेप सुधार को सही quantitate पूरी proteomes को जोड़ती है । इस प्रोटोकॉल निंनलिखित मुख्य चरणों में शामिल हैं: प्रोटीन निष्कर्षण और पाचन, टीएमटी लेबलिंग, 2 आयामी (2d) नियंत्रण रेखा, उच्च संकल्प जन स्पेक्ट्रोमेट्री, और गणना डेटा प्रोसेसिंग । गुणवत्ता नियंत्रण चरण समस्या निवारण और प्रयोगात्मक भिन्नता का मूल्यांकन करने के लिए शामिल किए गए हैं । स्तनधारी नमूनों में १०,००० से अधिक प्रोटीन इस प्रोटोकॉल के साथ आत्मविश्वास से quantitated हो सकते हैं । इस प्रोटोकॉल को मामूली बदलाव के साथ पोस्ट शोधों के संशोधनों के quantitation पर भी लागू किया जा सकता है । इस मल्टीप्लेक्स, मजबूत विधि जटिल नमूनों की एक किस्म में proteomic विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है, सेल संस्कृति, पशु ऊतकों, और मानव नैदानिक नमूनों सहित.
Introduction
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकी में अग्रिम जैविक प्रणालियों और मानव रोग के अध्ययन के लिए एक नया परिदृश्य के लिए नेतृत्व किया है । इस जीनोम की माप की एक बड़ी संख्या की अनुमति दी है, transcriptome, proteome, metabolome, और अंय आणविक प्रणालियों मूर्त बनने के लिए । मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान में सबसे संवेदनशील तरीकों में से एक है, और प्रोटियोमिक् में अपने आवेदन तेजी से मानव जीनोम के अनुक्रमण के बाद विस्तार किया गया है । प्रोटियोमिक् क्षेत्र में, पिछले कुछ वर्षों के एमएस-आधारित मात्रात्मक विश्लेषणों में प्रमुख तकनीकी अग्रिमों की पैदावार हुई है, जिसमें इंस्ट्रूमेंटेशन के अतिरिक्त isobaric लेबलिंग और मल्टीप्लेक्सिंग क्षमता व्यापक तरल क्रोमैटोग्राफी के साथ संयोजित की गई है अग्रिम, कम नमूना आवश्यक सामग्री के साथ तेजी से, अधिक सटीक माप के लिए अनुमति दी । मात्रात्मक प्रोटियोमिक् उच्च जटिल जैविक नमूनों में प्रोटीन और posttranslational संशोधनों के हजारों के दसियों की रूपरेखा के लिए एक मुख्यधारा दृष्टिकोण बन गए हैं1,2,3,4 , 5 , 6.
division isobaric लेबलिंग विधियाँ जैसे सापेक्ष और निरपेक्ष quantitation के लिए isobaric टैग (जैसे, iTRAQ) और मिलकर मास टैग (टीएमटी) एमएस ने नमूना प्रवाह में काफी सुधार किया है और नमूनों की संख्या में वृद्धि की है जो एक एकल में विश्लेषण किया जा सकता है प्रयोग1,6,7,8. अंय एमएस-आधारित quantitation विधियों, जैसे लेबल मुक्त quantitation और स्थिर आइसोटोप के साथ लेबलिंग सेल संस्कृति में अमीनो एसिड के साथ (यानी, SILAC), प्रोटियोमिक् क्षेत्र में इन तकनीकों की क्षमता काफी है9 ,10,11. उदाहरण के लिए, टीएमटी विधि 10-plex रिएजेंट का उपयोग करके 1 प्रयोग में एक साथ विश्लेषण करने के लिए १० प्रोटीन नमूनों को अनुमति देता है । इन संरचनात्मक समान टीएमटी टैग एक ही समग्र द्रव्यमान है, लेकिन भारी आइसोटोप अंतर कार्बन या नाइट्रोजन परमाणुओं पर वितरित कर रहे हैं, प्रत्येक टैग के एमएस/ms विखंडन के दौरान एक अद्वितीय रिपोर्टर आयन में जिसके परिणामस्वरूप, जिससे रिश्तेदार quantitation सक्षम 10 नमूनों के बीच । टीएमटी रणनीति जैविक रास्ते, रोग प्रगति, और सेलुलर प्रक्रियाओं12,13,14का अध्ययन करने के लिए नियमित रूप से लागू किया जाता है ।
पर्याप्त तकनीकी सुधार है तरल क्रोमैटोग्राफी (नियंत्रण रेखा)-एमएस/एमएस सिस्टम, दोनों नियंत्रण रेखा जुदाई और एमएस मापदंडों के संदर्भ में, quantitation सटीकता त्याग के बिना प्रोटीन की पहचान को अधिकतम करने के लिए । दूसरे आयाम के लिए उच्च orthogonality के साथ एक जुदाई तकनीक द्वारा पेप्टाइड्स के पहले आयाम जुदाई शॉटगन प्रोटियोमिक् विधि के इस प्रकार के लिए अधिकतम परिणाम20प्राप्त करने में महत्वपूर्ण है । उच्च पीएच उलट-चरण तरल क्रोमैटोग्राफी (RPLC) बेहतर प्रदर्शन प्रदान करता है से पारंपरिक मजबूत कटियन-विनिमय क्रोमैटोग्राफी20। जब उच्च पीएच RPLC कम पीएच RPLC के एक दूसरे आयाम के साथ संयुक्त है, दोनों विश्लेषणात्मक गतिशील रेंज और प्रोटीन कवरेज में सुधार कर रहे हैं, व्यक्त प्रोटीन के थोक की पहचान करने के लिए जब पूरे प्रदर्शन-proteome विश्लेषण की क्षमता में जिसके परिणामस्वरूप15 ,16,17,18. अंय तकनीकी अग्रिमों छोटे C18 कणों (१.९ µm) और विस्तारित लंबे स्तंभ (~ 1 m)19शामिल हैं । इसके अलावा, अंय उल्लेखनीय सुधार तेजी से स्कैन दर, बेहतर संवेदनशीलता और संकल्प20, और एमएस डाटा खनन21के लिए परिष्कृत bioinformatics पाइपलाइन के साथ बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के नए संस्करणों में शामिल हैं ।
यहां, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल है कि संशोधनों के साथ सबसे हाल के तरीके शामिल दोनों संवेदनशीलता और प्रवाह में सुधार का वर्णन है, जबकि प्रयोग में गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र पर ध्यान केंद्रित । प्रोटोकॉल में प्रोटीन निष्कर्षण और पाचन, टीएमटी 10-plex लेबलिंग, बेसिक पीएच और एसिड पीएच RPLC अंश, उच्च संकल्प एमएस डिटेक्शन, और एमएस डाटा प्रोसेसिंग (चित्रा 1) शामिल हैं । इसके अलावा, हम समस्या निवारण के लिए कई गुणवत्ता नियंत्रण चरणों को लागू करने और प्रयोगात्मक भिंनता का मूल्यांकन । इस विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए शोधकर्ताओं ने क्षेत्र के लिए नए नियमित रूप से पहचान और सही एक lysate या ऊतक से प्रोटीन के हजारों quantitate मदद करना है ।
Protocol
सावधानी: कृपया उपयोग से पहले सभी प्रासंगिक सुरक्षा डाटा शीट ( यानी , MSDS) से परामर्श करें । इस प्रोटोकॉल को करते समय कृपया सभी उपयुक्त सुरक्षा अभ्यासों का उपयोग करें ।
नोट: एक टीएमटी 10-plex isobar…
Representative Results
Discussion
हम 10-plex isobaric लेबलिंग रणनीति के साथ प्रोटीन के quantitation के लिए एक उच्च-प्रवाह प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो कई प्रकाशनों में सफलतापूर्वक लागू किया गया है12,13,14,३२ </su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक उपयोगी चर्चा के लिए अंय सभी लैब और सुविधा के सदस्यों को धंयवाद । इस काम को नी H पलाश R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987, और ALSAC ने आंशिक रूप से समर्थन दिया था । एमएस विश्लेषण NIH कैंसर केंद्र सहायता अनुदान P30CA021765 द्वारा आंशिक रूप से समर्थित सेंट झड बच्चों के शोध अस्पताल प्रोटियोमिक् सुविधा में किया गया था । लेखकों ने पांडुलिपि के संपादन में मदद के लिए निशा Badders का धन्यवाद किया ।
Materials
| 1220 LC system | Agilent | G4288B | |
| 50% Hydroxylamine | Thermo Scientific | 90115 | |
| Acetonitrile | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BB24-AU | |
| Butterfly Portfolio Heater | Phoenix S&T | PST-BPH-20 | |
| C18 tips | Harvard Apparatus | 74-4607 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 | |
| DMSO | Sigma | 41648 | |
| Formic acid | Sigma | 94318 | |
| Fraction Collector | Gilson | FC203B | |
| Glass Beads | Next Advance | GB05 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I6125 | |
| Lys-C | Wako | 125-05061 | |
| Methanol | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive HF | |
| nanoflow UPLC | Thermo Scientific | Ultimate 3000 | |
| ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um | Dr. Maisch GmbH | r119.aq.0003 | |
| Self Pck Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Speedva | Thermo Scientific | SPD11V | |
| TMT 10plex Isobaric label reagent | Thermo Scientific | 90110 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Applied Biosystems | 400003 | |
| Trypsin | Promega | V511C | |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Xbridge Column C18 column | Waters | 186003943 | |
| Ziptips C18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| SepPak 1cc 50mg | Waters | WAT054960 |
References
- Pagala, V. R., et al. Quantitative protein analysis by mass spectrometry. Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).
- Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14 (1), 35-48 (2013).
- Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Bai, B., et al. Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling. Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Anal Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run. Anal Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Bai, B., et al. Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer’s disease. J Proteome Res. 13 (11), 4526-4534 (2014).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. Recent advances of proteomics applied to human diseases. J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).
- Churchman, M. L., et al. Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancer Cell. 28 (3), 343-356 (2015).
- Wang, X., et al. Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk. Nat Commun. 7, 10464 (2016).
- Mertz, J. L., et al. Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth. Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Wang, H., et al. An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Song, C., et al. Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides. Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).
- Wang, H., et al. Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome. J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).
- Hebert, A. S., et al. The one hour yeast proteome. Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).
- Wang, X., et al. JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).
- Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
- Niu, M., et al. Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry. Anal Chem. 89 (5), 2956-2963 (2017).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
- Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
- Wenger, C. D., et al. Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging. Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).
- McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes. Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
- Zhou, F., et al. Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry. Nat Commun. 4, 2171 (2013).
- Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
- Ahrne, E., et al. Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments. J Proteome Res. 15 (8), 2537-2547 (2016).
- Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
- Tan, H., et al. Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation. Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).
- Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells. Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).
- Tan, H., et al. Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome. Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).
- Li, Y., et al. JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells. J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).
- Yuan, Y., et al. Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types. Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).
- Nesvizhskii, A. I. Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies. Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).
- Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).
