Induktion og Micro-CT billeddannelse af Cerebral bundløs misdannelser i musen Model
Summary
Denne protokol viser induktion af cerebral bundløs misdannelser sygdom i en musemodel og bruger kontrast forbedret mikro computertomografi for at måle læsion byrde. Denne metode øger værdien af etablerede musemodeller at studere det molekylære grundlag og potentielle terapier for cerebral bundløs misdannelser og andre cerebrovaskulære sygdomme.
Abstract
Mutationer i den CCM1 (aka KRIT1), CCM2, eller CCM3 (aka PDCD10) genet forårsage cerebral bundløs misdannelser (CCM) i mennesker. Musemodeller af CCM sygdom har været etableret af tamoxifen induceret sletning af Ccm gener i postnatal dyr. Disse musemodeller give uvurderlige værktøjer for at undersøge molekylære mekanisme og terapeutiske tilgange til CCM sygdom. En nøjagtig og kvantitativ metode til at vurdere læsion byrde og progression er vigtigt at udnytte den fulde værdi af disse dyremodeller. Her, vi vise induktion af CCM sygdom i en musemodel og brug af kontrasten forbedrede X-ray mikro computertomografi (mikro-CT) metode til foranstaltning CCM læsion byrde i mus hjerner. På postnatal dag 1 (P1) brugte vi 4-hydroxytamoxifen (4HT) til at aktivere Cre recombinase aktivitet fra Cdh5-CreErt2 transgen til kløver floxed allel af Ccm2. CCM læsioner i mus hjerner blev analyseret P8. For mikro-CT, blev jod baseret Lugol løsning brugt til at forbedre kontrasten i hjernevæv. Vi har optimeret scanningsparametrene og udnyttet en voxel dimentional i 9.5 µm, som fører til et minimum funktion størrelse af ca 25 µm. Denne beslutning er tilstrækkelig til at måle CCM læsion volumen og antallet globalt og præcist, og levere høj kvalitet 3D-kortlægning af CCM læsioner i mus hjerner. Denne metode øger værdien af de etablerede musemodeller at studere molekylære grundlag og potentielle terapier for CCM og andre cerebrovaskulære sygdomme.
Introduction
CCM er tynde vægge, dilaterede vaskulære misdannelser i hjernen med forekomsten af op til 0,5% i den menneskelige befolkning1. CCM kan nedarves som en dominant lidelse på grund af tab af funktion mutationer i en af tre gener: CCM1 (aka Krit1), CCM2og CCM3 (også kaldet PDCD10)2,3,4 ,5,6. Disse gener er til stede i en enkelt signalering komplekse.
Forskellige modeller er blevet udviklet til model menneskelige CCM sygdom og at forstå de downstream veje af CCM gener, der er ansvarlig for CCM7,8,9,10. Den mest robuste model er betinget slette en af Ccm gener med tamoxifen-inducerbar Cdh5-CreERT2 på P1 i nyfødte unger8,10. Disse hvalpe udvikle CCM læsioner i hjernen fra P6 fremefter og forventes at være en ideel model for prækliniske undersøgelser i søgen efter mekanismer og terapeutiske agenter i behandling af CCM sygdomme.
CCM læsion byrde i mus hjernen er blevet målt primært af histologi-baserede metoder, en tilgang, der er ekstremt tidskrævende og underlagt investigator bias10,11,12. Mr baseret metoder har været anvendt til at vurdere CCM læsion byrde i voksen mus model9,13. Dog er et stærkt specialiserede små dyr Mr instrument og scan-længe flere timer at overnatte kræves for at opnå en tilfredsstillende løsning at identificere CCM læsioner. Også, om Mr kan anvendes til at påvise CCM læsioner i neonatal mus er ikke blevet rapporteret og opløsning kan begrænse følsomhed.
Vi har for nylig udviklet en mikro-CT teknik at billede og analysere CCM læsion14,15. Denne høje opløsning, tid og omkostningseffektiv metode dramatisk boostet værdien af CCM sygdom model i mekanistiske og terapeutiske undersøgelser. Øgning af kontrast, hele mount farvning metoder har været anvendt til micro-CT billeddannelse af blødt væv og mus embryoner16,17. Vi har tidligere brugt en osmium-baserede farvning for at forbedre kontrasten for micro-CT billeddannelse af CCM læsioner i hjernen14. I dette papir, vi brugte en mindre giftig, ikke-destruktiv, og omkostningseffektiv reagens, en jod baseret Lugols løsning, for at forbedre kontrasten for micro-CT billeddannelse. Jod kan diffuse hele hjernen og har en høj affinitet for blod18.
Den detaljerede protokollen er præsenteret her for induktion af CCM læsioner i en neonatal musemodel sammen med billedbehandling og analyse af CCM læsioner med en kontrast-baseret mikro-CT. Mikro-CT baseret metode giver kvantitative globale mål for CCM læsion volumen, præcist identificerer antallet og 3D-placeringen af CCM læsioner i hjernen, mus og reducerer omkostningerne og tiden skal fænotype disse dyr.
Protocol
Representative Results
Discussion
CCM er en fælles vaskulære misdannelser, der påvirker op til 0,5% af individer1. CCM kan forekomme sporadiske eller familiær form. Patientens prognose er ofte uklart, da CCM læsioner kan briste uventet for at forårsage slagtilfælde og andre neurologiske konsekvenser. I øjeblikket er den eneste behandlingsmulighed kirurgisk fjerne læsioner, som er ledsaget af høj risiko.
Menneskelige CCM betingelser er for nylig blevet gengivet i dyre modeller…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender faciliteterne og den videnskabelige og tekniske bistand fra Sydney mikroskopi & mikroanalyser Research Facility (AMMRF) og den australske centrum for mikroskopi & mikroanalyser (ACMM) på University of Sydney. Disse undersøgelser blev støttet af Australian National Health og Medical Research Rådet (NHMRC) projektet give 161558 og APP1124011 (XZ).
Materials
| 4-hydroxy tamoxifen | Sigma-Aldrich | H6278 | To activate Cdh5-CreErt2 |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | To dilute 4-hydroxy tamoxifen |
| Stereomicroscope | Leica | M205FA | To take macroscopic images |
| Lugol's Iodine solution | Sigma-Aldrich | L6146 | To stain samples for contrast micro-CT |
| Plastic paraffin film | Parafilm | PM992 | To package samples |
| Micro-CT | Xradia | MicroXCT-400 | Micro-CT |
| 3D rendering software | FEI Visualization Science group | Avizo 3D image processing software | To analyse micro-CT scans |
References
- Fischer, A., Zalvide, J., Faurobert, E., Albiges-Rizo, C., Tournier-Lasserve, E. Cerebral cavernous malformations: from CCM genes to endothelial cell homeostasis. Trends Mol Med. 19 (5), 302-308 (2013).
- Liquori, C. L., et al. Mutations in a gene encoding a novel protein containing a phosphotyrosine-binding domain cause type 2 cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 73 (6), 1459-1464 (2003).
- Laberge-le Couteulx, S., et al. Truncating mutations in CCM1, encoding KRIT1, cause hereditary cavernous angiomas. Nat Genet. 23 (2), 189-193 (1999).
- Sahoo, T., et al. Mutations in the gene encoding KRIT1, a Krev-1/rap1a binding protein, cause cerebral cavernous malformations (CCM1). Hum Mol Genet. 8 (12), 2325-2333 (1999).
- Denier, C., et al. Mutations within the MGC4607 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 74 (2), 326-337 (2004).
- Bergametti, F., et al. Mutations within the programmed cell death 10 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 76 (1), 42-51 (2005).
- McDonald, D. A., et al. A novel mouse model of cerebral cavernous malformations based on the two-hit mutation hypothesis recapitulates the human disease. Hum Mol Genet. 20 (2), 211-222 (2011).
- Boulday, G., et al. Developmental timing of CCM2 loss influences cerebral cavernous malformations in mice. J Exp Med. 208 (9), 1835-1847 (2011).
- Chan, A. C., et al. Mutations in 2 distinct genetic pathways result in cerebral cavernous malformations in mice. J Clin Invest. 121 (5), 1871-1881 (2011).
- Zheng, X., et al. Cerebral cavernous malformations arise independent of the heart of glass receptor. Stroke. 45 (5), 1505-1509 (2014).
- McDonald, D. A., et al. Fasudil decreases lesion burden in a murine model of cerebral cavernous malformation disease. Stroke. 43 (2), 571-574 (2012).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Gibson, C. C., et al. Strategy for identifying repurposed drugs for the treatment of cerebral cavernous malformation. Circulation. 131 (3), 289-299 (2015).
- Choi, J. P., et al. Micro-CT Imaging Reveals Mekk3 Heterozygosity Prevents Cerebral Cavernous Malformations in Ccm2-Deficient Mice. PLoS One. 11 (8), 0160833 (2016).
- Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532 (7597), 122-126 (2016).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiol. 9, 11 (2009).
- Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), 61 (2006).
- Anderson, R., Maga, A. M. A Novel Procedure for Rapid Imaging of Adult Mouse Brains with MicroCT Using Iodine-Based Contrast. PLoS One. 10 (11), 0142974 (2015).
- Zheng, X., et al. Dynamic regulation of the cerebral cavernous malformation pathway controls vascular stability and growth. Dev Cell. 23 (2), 342-355 (2012).
