Denne protokol beskriver den elektrofysiologiske evaluering af murine forkamre udnytter en optisk mapping system med en høj tidsmæssige og rumlige opløsning, herunder dual optagelser af membran spænding og Ca2 + forbigående under programmeret stimulering gennem en specialiseret elektrode kateter.
Seneste genome-wide association studier målretning atrieflimren (AF) har angivet en stærk association mellem genotype og elektrofysiologiske fænotype i hjertets forkamre. Det tilskynder os til at udnytte en genetisk manipuleret musemodel for at belyse virkningsmekanismen AF. Det er imidlertid vanskeligt at vurdere de elektrofysiologiske egenskaber i murine forkamre på grund af deres lille størrelse. Denne protokol beskriver den elektrofysiologiske evaluering af atria ved hjælp af en optisk mapping system med en høj tidsmæssige og rumlige opløsning i Langendorff perfunderet murine hjerter. Optisk mapping system er samlet med dobbelt højhastigheds komplementær metal oxide semiconductor kameraer og høj forstørrelse målet linser, at opdage fluorescens af en spænding-følsomme farvestof og Ca2 + indikator. For at fokusere på vurdering af murine forkamre, er optisk kortlægning udført med et areal på 2 mm × 2 mm eller 10 mm x 10 mm, med en 100 × 100 opløsning (20 µm/pixel eller 100 µm/pixel) og samplingfrekvens op til 10 kHz (0,1 ms) på maksimum. En 1-fransk størrelse quadripolar elektrode pacing kateteret placeres i højre forkammer gennem den overlegne vena cava undgå mekaniske skader til atriet og pacing stimulation leveres gennem kateteret. En elektrofysiologiske undersøgelse er udført med programmerede stimulation herunder konstant pacing, brast pacing, og op til tredobbelt extrastimuli pacing. Under en spontan eller pacing rytme, registreres den optiske kortlægning aktionspotentialet varighed, aktivering kort, overledning hastighed og Ca2 + forbigående individuelt i højre og venstre forkamre. Derudover bestemmer de programmerede stimulation også inducibility af atrieflimren hjertebanken. Præcise aktivering kortlægning udføres for at identificere formering af excitation i atriet under en induceret atrieflimren takyarytmi. Optisk kortlægning med en specialiseret indstilling giver mulighed for en grundig elektrofysiologiske evaluering af atriet i murine patologiske modeller.
Hjertet består af 4 kamre i pattedyr. De øverste to kamre er forkamre, og de lavere er hjertekamrene. Hjertekamrene arbejder som en pumpe til at skubbe blod til den systemiske eller pulmonal cirkulation. Forkamre modtage blod vender tilbage fra de systemiske eller pulmonal venerne, og bistå i transport af blod i ventrikler at opnå en effektiv hjerte pumpe funktion. Fra en elektrofysiologiske aspekt er hjertets forkamre vigtige funktion at regulere hjerterytmen. De elektriske signaler stammer fra sinusknuden placeret ved krydset mellem den overlegne vena cava (SVC) og højre atrium (RA), og derefter overføres til RA og venstre atrium (LA), og føre til ventrikel gennem AV-knuden og hans-Purkinje ledningssystem.
Arytmier, som er hjerterytmeforstyrrelser, inddeles i atrielle og ventrikulære efter deres oprindelse. Atrieflimren (AF) er den mest almindelige vedvarende form af en arytmi, karakteriseret ved en tilfældig og hurtige excitation af hjertets forkamre. Nyere genetiske analyser og genome-wide association studier (GWAS) har vist tilknytningen mellem AF og genetiske mutationer eller monopolymorphisms1,2,3,4. Disse resultater viser, AF er i det mindste delvis forbundet med en genetiske årsag. Derfor er det kritisk at vurdere genotype-fænotype interaktioner i hjertets forkamre, ved hjælp af en genetisk manipuleret dyremodel. Det er almindeligt accepteret, at musen er den mest etablerede pattedyr til genetisk modifikation.
Den optiske kortlægning teknik er udviklet til at evaluere excitation af hjertet væv. Observation af murine atrium af optiske kortlægning er imidlertid hæmmet af sin forholdsvis lille størrelse. Vi forsøger at opnå en detaljeret vurdering af murine atrium med en høj tidsmæssige og rumlige opløsning.
Optisk mapping er en veletableret manøvre for at studere den kardiale Elektrofysiologi7, og er en ganske nyttig værktøj til at vurdere ventrikulære arytmier8,9, men også atrieflimren dem10,11 . Samtidige kortlægning af transmembrane potentiale og Ca2 + transienter er nyttige for at forstå de underliggende mekanismer af arytmi i forhold til hjertesvigt og andre hjertesygdomme12,13. Når man sammenligner de andre elektrofysiologiske vurderingsmetoder, såsom dem, der bruger en enkelt celle eller celle ark, en af de absolutte superiorities optisk kortlægning i til perfused hjertet er vurderingen af varmeledning mønster i den intakte atrium og ventrikel, induceret ikke kun under sinusrytme, men også under arytmier14. Et forsøg på at udnytte murine hjerter, især atrium, som et surrogat for mennesker er stødt på vanskeligheder hovedsageligt på grund af deres lille størrelse, men musen er en attraktiv eksperimentel model med hensyn til vurderingen i en genetisk manipuleret dyr model, og dette problem skal løses. Vores tilgang giver én retning for at løse konflikten.
Selv om vores tilknytning af optiske apparater var dybest set svarer til det konventionelle system for hele murine hjerter15, har vores metode fordelen at vurdere murine atrium ved at foretage nogle ændringer i det. Først, vi forfølger for at opnå en høj rumlige og tidsmæssige opløsning på op til 0,1 ms/ramme og 20 µm/pixel og denne høj opløsning kortlægning bidraget til en mere præcis måling af varmeledning hastighed og formering mønster i murine atrium. For det andet for at undgå unødvendige mekaniske skader eller strækning af atrium, som kunne ændre elektrofysiologiske egenskaber 16,17, indsættes en iboende nål direkte i LV til at reducere trykket intra-kammer stedet for at indsætte det gennem LA, som udføres i den tidligere undersøgelse15. Derudover pacing stimulus er leveret gennem en custom made 1-fransk størrelse elektrode kateteret placeres i RA, men ikke af en nål-elektrode, som kan skade atrium. Nogen ben undgås ved fastsættelsen af den atriale vedhæng, som blev brugt i den tidligere undersøgelse15. For det tredje med hensyn til vurdering af den underliggende mekanisme i arytmier er en programmeret stimulation protokol at fremkalde atrieflimren hjertebanken afgørende18,19. Vi udføre programmeret stimulation identisk i klinisk elektrofysiologiske undersøgelser, herunder burst pacing og tredobbelt extrastimuli pacing, med en ændring af den pacing interval for musen hjerte. Således ud over parametrene baseline måling kunne protokollen evaluere ved inducibility. Når det er nødvendigt, vurderet ved inducibility med administrationen af isoprenalin eller andre stoffer. Vores erfaring vise wild-type mus næppe nogen ATs selv efter en fuld stimulation protokol. Derfor bør inducibility af AT være vigtige oplysninger til evaluering af flere patologiske tilstande som genetiske mutationer, kirurgiske procedurer og administration af medicin11bidrag. Disse ændringer kunne optimere den præcise elektrofysiologiske vurdering i den intakte murine atrium.
Denne metode har også nogle begrænsninger. Først ved hjælp af en maksimal rumlige opløsning med en 5 X mål linse, field of view (FOV) er begrænset til en del af atriet (dvs. kun den venstre atriale vedhæng som vist i figur 2a). For at opnå større FOV af atriet, er en 1,6 X mål linse undertiden at foretrække (figur 2b). For det andet uden fastsættelse af atriet med knappenåle, nogle gange er det vanskeligt at måle atrial overledning egenskaber korrekt, fordi den atriale overflade er buet. Så, vi placeret cover glas på dens overflade at flade det i stedet for at løse det af pins. Denne metode er også gavnligt for at forhindre bevægelse artefakt fra vibrationer af løsningen. For det tredje, med vores metode, det er ganske vanskeligt at opnå den hele FOV af det, så at bruge visningen anteriore og posteriore korrekt er vigtigere i vores tilgang end i anden tilgangen som vist i figur 2. Fordelen ved den forreste opfattelse ville være klart observation af reentry for patologiske tilstande, især i vedhæng (figur 4). På den anden side den bageste opfattelse er en fordel at få et godt overblik over den atriale bageste væg, og kan være en detaljeret registrering af udløser aktivitet fra Myokardie ærmet. Når det er vanskeligt at opnå en passende vis og at flade sine buet overflade med vores metode, kan atrium være fastgjort med minimal spænding af pins.
Med vores metode er der 3 mulige problemer, fejl i farvningen, pacing, og arytmi induktion. For manglende farvning, hvis ingen eller svag fluorescens er overholdt, skal du kontrollere om optisk kortlægning apparater er korrekt samlet, og hvorvidt reagenset er passende gemmes og bruges. Tilstanden af perfusion løsning er også afgørende, hvilket også kan påvirke de elektrofysiologiske egenskaber af hjertet selv, så tilstanden af løsning herunder pH, temperatur, og om der var nok beluftning skal overvåges nøje. Det er også vigtigt at undgå enhver luft emboli i hjertet. For pacing fiasko, hvis de pacing stimuli ikke kan ophidse atrium, bør forskere kontrollere, om ledninger er korrekt ved hjælp af et kredsløb tester. Når de pacing stimuli er korrekt udsendes, er problemet kontakt af elektrode med væv. Repositionering af elektroderne kan løse problemet, og vores tilgang med pacing kateteret gør det nemt. For sværhedsgrad i arytmi induktion, kan RV pacing anvendes til induktion af en AT i visse begrænsede tilfælde. Ved hjælp af en quadripolar elektrode kateter som distale to elektroder og proksimale elektroder kan være placeret i RV og RA, henholdsvis, er det nemt at ændre webstedet pacing fra RA til RV. Denne kateter er også nyttige til at flytte den ventrikulære excitation, når en samtidig ventrikulær aktivering signal masker atrieflimren excitation signal.
Denne metode vil bidrage til vurderingen af genotype-fænotype interaktioner i vinduet AF relaterede gener nyligt fundet af de roman undersøgelser såsom GWAS, især for de gener, som undersøgelsen mislykkedes at vise dem ved andre metoder. Med udviklingen af enheder og teknikker, kan de elektrofysiologiske egenskaber af pulmonale vene ærme, som er en vigtig kilde til AF20, vurderes i det intakte hjerte med denne tilgang.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde støttes af programmet for forbedring af forskningsmiljø for unge forskere fra særlige koordinering midler til fremme af videnskab og teknologi (SCF) (til T.S.), Grants-in-Aid for videnskabelig forskning (nr. 16K 09494, til T.S., No. 26293052, til T.F.) fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi (MEXT) i Japan. Vi sætter pris på Brainvision og Mr. Kenji Tsubokura for den tekniske bistand, og vi værdsætter også Mr. John Martin for hans sproglig bistand.
(-)-Blebbistatin | SIGMA | B0560-1MG | E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping |
RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
Rhod2AM | Biotium | 50024 | Ca indicator |
Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Biotium | #59000 | To enhance the staining with Rhod2AM |
Di-4-ANEPPS | Wako | 041-29111 | Voltage-sensitive dye |
Dimethyl sulfoxide | Wako | 046-21981 | Solvent for reagents |
Bottle top filter | Corning | 430513 | For filtering Tyrode's solution |
Haparin Sodium | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd | N/A | To avoid blood clots in the coronary artery |
Air stone (φ8 mm x 10 mm) | Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho | N/A | for aeration |
Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku Corporation | N/A | For an anesthesia |
Programmable stimulator | Fukuda Denshi | BC-05 | Fukuda Denshi kindly rented us. |
Power Lab | AD Instruments | Powerlab 26/8SP | To record blood pressure and electrocardiogram |
Bio Amp | AD Instruments | ML132 | Amprifier for electrocardiogram |
BP Amp | AD Instruments | FE117 | Amprifier for blood pressure |
LabChart | AD Instruments | Version 7 | Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram |
Disposable BP transducer | AD Instruments | MLT0670 | pressure transducer |
1-Fr custom made electrode catheter | Unique Medical | N/A | To pace right atrium |
Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) | Natume Seisakujo | SP31 | Put into superior vena cava to introduce electrode catheter |
Millex-SV 5.00 μm | Merk Millipore | SLSV025LS | To filter the circulating Tyrode |
24-gauge indwelling needle | TERUMO | SR-FS2419 | Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber |
21-gauge needle | TERUMO | SN-2170 | We cut the tip of needle and blunted it by filing |
25-guage needle | TERUMO | NN-2525R | |
1-ml syringe | TERUMO | SS-01T | |
PVC tube | TERUMO | SF-ET0525 | for Langendorff's perfusion circuit |
Three-way stopcock | TERUMO | TS-TL2K | for Langendorff's perfusion circuit |
Petri dish | As one | 3-1491-01 | |
Custum made heating glass coil | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Custum made warming glass chamber | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Constant temperature circulating device | Lauda | E100 | connected to heating coil and warming chamber |
Cover glass (25 mm × 60 mm) | Matsunami | C025601 | Put on the atria to flatten the recording area |
Perista pump | ATTO | SJ-1211 | peristaltic pump |
Stemi DV4 | Carl Zeiss | N/A | Stereomicroscope |
MiCAM ULTIMA-L2 | Brainvision Inc. | UL-L2 | Optical mapping System |
BV_Ana Software | Brainvision Inc. | BV_Ana | Data Analysis Software |
THT Macroscope | Brainvision Inc. | THT-ZS | Epi-Illumination Unit |
LED Light Source | Brainvision Inc. | LEX2-G | |
Dichroic Mirror 560nm | Brainvision Inc. | DM560 | Epi-Illuminatinon |
Excitation Filter 520/35nm | Semrock, Inc. | FF01-520/35-25 | |
Projection lens Plan S 1.0X | Carl Zeiss | 435200-0000-000 | |
Focus Drive | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Objective lens Revolver | Carl Zeiss | 435302-0000-000 | |
Manual Focus Column | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Macroscope Base | Carl Zeiss | 435430-9901-000 | |
Straight Light Guide | MORITEX Corporation | MSG10-2200S | Epi-Illuminatinon |
Condenser Lens | MORITEX Corporation | ML-50 | |
PLANAPO 5.0X | Leica Microsystems | 10447243 | Objective Lens |
PLANAPO 1.0X | Leica Microsystems | 10447157 | Objective Lens |
PLANAPO 1.6X | Leica Microsystems | 10447050 | Objective Lens |
Beam-Splitter | Brainvision Inc. | FLSP-2 | |
Dichroic Mirror 665nm | Brainvision Inc. | DM665 | Beam-Splitter |
Emission Filter 572/28nm | Edmund Optics | #84-100 | Rhod2-AM |
Emission Filter 697/75nm | Semrock, Inc. | FF01-697/75-25 | RH237 and Di-4-ANEPPS |
0.2 mL PCR tube | Greiner Bio-One | 671201 | |
aluminum foil | Toyo alumi | 0020 |