이 프로토콜 설명 electrophysiological murine atria는 높은 시간적, 공간적 해상도, 막 전압의 듀얼 녹음을 포함 한 광학 매핑 시스템을 활용 하 여 평가 하 고 캘리포니아2 + 에서 과도 프로그램 특수 전극 카 테 터를 통해 자극입니다.
최근 게놈 넓은 협회 연구 결과 심 방 섬유 성 연 축 (AF)를 대상으로 유전자는 atria에 electrophysiological 표현 형 사이 강한 협회를 표시 했습니다. 그 우리 AF의 메커니즘을 명료 하 게 하는 유전으로 설계 된 마우스 모델을 활용 하는 것을 권장 합니다. 그러나, 그들의 작은 크기로 인해 murine atria에 electrophysiological 속성을 평가 하기 어렵습니다. 이 프로토콜 electrophysiological atria Langendorff 끼얹는다 murine 마음에 높은 시간적, 공간적 해상도 광학 매핑 시스템을 사용 하 여 평가 설명 합니다. 광학 매핑 시스템 듀얼 고속 보완 금속 산화물 반도체 카메라와 고배율 렌즈, 전압에 민감한 염료 및 캘리포니아2 + 표시기의 형광을 검출 하기 위하여 조립 된다. Murine atria의 평가에 초점, 광학 매핑 2 m m × 2 m m 또는 10 m m x 10 m m, 100 × 100 해상도 (20 µ m/픽셀 또는 100 µ m/픽셀)와 10 khz (0.1 ms) 최대 샘플링 속도의 영역으로 수행 됩니다. 1 프랑스 크기 quadripolar 전극 카 테 터를 서 성 아 트리 움에 기계적 손상을 피하 뛰어난 베 나 정 맥을 통해 오른쪽 아 트리 움으로 배치 되 고는 카 테 테 르 통해 전달 자극 성. 일정 성 등 프로그램 자극 electrophysiological 연구 수행, 서 성, 그리고 트리플 extrastimuli 성 파열. 자연 또는 리듬 성, 광학 매핑 활동 전위 기간, 활성화 지도, 전도 속도, 및 캘리포니아2 + 과도 오른쪽과 왼쪽 atria에 개별적으로 기록. 또한, 프로그램 된 자극은 심 방 tachyarrhythmias의 inducibility를 결정합니다. 정확한 정품 인증 매핑 유도 atrial tachyarrhythmia 동안 안마당에서 여기의 전파를 식별 하기 위해 수행 됩니다. 특수 설정 광학 매핑 murine 병 적인 모델에서 안마당의 철저 한 electrophysiological 평가 수 있습니다.
포유류에서 4 챔버가 마음에 의하여 이루어져 있다. 위 두 개의 챔버는 심 방, 되며 낮은 사람 심. 심 전신 또는 폐 순환 하는 혈액을 추출 펌프 작동 합니다. 심 방 조직 또는 폐 정 맥에서 돌아오는 혈액을 받을 고 심으로 혈액을 운반 효율적인 심장 펌프 기능을 얻기 위해. Electrophysiological 측면에서는 atria의 중요 한 기능은 심장 리듬 조절입니다. 전기 신호 뛰어난 베 나 정 맥 (SVC)와 오른쪽 아 트리 움 (RA) 사이의 교차점에 있는 부 비 동 노드에서 발생 그리고 RA와 왼쪽된 아 트리 움 (LA), 전파 atrioventricular 노드 및 그의 Purkinje 심 실 하 실시 유도 시스템입니다.
심장 리듬 장애, 부정맥, 심 방 및 심 실 그들의 기원에 따르면로 분류 됩니다. 심 방 섬유 성 연 축 (AF)은 무작위이 고 신속한 여기는 심 방의 특징, 부정맥의 가장 일반적인 지속적인된 형태 이다. 최근 유전 분석 및 게놈 넓은 협회 연구 결과 (GWAS) AF와 유전자 변이 또는 monopolymorphisms,12,,34사이 협회를 보여주었다. 이러한 연구 결과 어 적어도 부분적으로 유전 원인에 연관 나타냅니다. 따라서, 그것은 유전자 조작 동물 모델을 사용 하 여 심 방에 인 자형 표현 형 상호 작용을 평가 하는 중요 한입니다. 그것은 널리는 마우스 유전자 조작에 대 한 가장 설립 된 포유동물은 허용 됩니다.
광학 매핑 기술 심장 조직의 흥분을 평가 하기 위해 개발 되었습니다. 그러나, 광학 매핑에 의해 murine 아 트리 움의 관찰의 상대적으로 작은 크기에 의해 방해 된다. 우리는 시간적, 공간적 고해상도 murine 아 트리 움의 상세한 평가 달성 하려고 합니다.
광학 매핑 심장 전기 생리학7공부에 대 한 확고 책략 이며 심 실 부정맥8,9, 뿐만 아니라 심 방 들을 평가 하는 매우 유용한 도구10,11 . 막 횡단 잠재력 및 캘리포니아2 + 과도 동시 매핑 심장 마비 및 다른 심장 질환12,13관련 된 부정맥의 근본적인 메커니즘을 이해 하는 데 유용 합니다. 단일 셀 또는 셀 시트를 사용 하 여 같은 다른 electrophysiological 평가 방법 비교 perfused 마음에 광학 매핑의 절대 우월 중 하나입니다 그대로 중앙홀에 전도 패턴의 평가 심 실, 부정맥14를 유도 하는 부 비 동 리듬 중 뿐만 아니라 중. 그러나 Murine 마음, 특히 아 트리 움, 인간의 대리로 서 활용 하는 시도 그들의 작은 크기 때문에 주로 어려움 발생 했습니다, 그리고, 마우스는 유전자 조작 동물에 평가 측면에서 매력적인 실험 모델 모델, 그리고이 문제는 극복 되어야 한다. 우리의 방법은 그것을 해결 하기 위해 한 방향으로 제공 합니다.
비록 우리의 광학 매핑 장치 전체 murine 마음15기존의 시스템에 기본적으로 유사 했다, 우리의 메서드는 murine 안마당을 일부 수정 하 여 평가의 이점이 있다. 첫째, 우리는 최대 0.1 ms/프레임 및 20 µ m/픽셀, 그리고이 고해상도 매핑 murine 안마당에서 전도 속도 및 전파 패턴의 더 정확한 측정에 기여의 높은 공간과 시간 해상도를 추구. 둘째, 불필요 한 기계적 손상이 나 electrophysiological 속성 16,17변경 수, 아 트리 움의 스트레치를 피하기 위해 내재 바늘 내부 챔버 압력을 줄이기 위해 라스베가스에 직접 삽입 됩니다. 이전에 수행 하는 라를 통해 삽입 하는 대신 연구15. 또한, 서 성 자극, RA에 주문 품된 1-프랑스 크기 전극 카 테 테 르 통해 전달 하지만 하지 바늘 전극에 의해는 아 트리 움 손상 수 있습니다. 어떤 핀은 지난 연구15에 사용 했다는 심 돌출부를 해결에 피 한다. 셋째, 평가 부정맥의 기본 메커니즘의 측면에서 atrial tachyarrhythmias 유도 프로그램된 자극 프로토콜은 중요 한18,19입니다. 우리 임상 electrophysiological 연구, 버스트 속도 트리플 extrastimuli 마우스 마음에 대 한 서 성 간격의 수정, 서 성까지 프로그램된 자극 동일을 수행 합니다. 따라서, 초기 측정 매개 변수 외에 프로토콜 AT의 inducibility 평가 수 있습니다. 필요할 때, AT의 inducibility isoproterenol 또는 다른 약물의 관리와 평가 이다. 우리의 경험 야생-타입 마우스는 거의 전체 자극 프로토콜 후에 어떤 ATs 보여. 따라서,의 inducibility 유전자 돌연변이, 수술, 약11의 관리 등 여러 가지 병 적인 조건에의 기여를 평가 하기 위한 중요 한 정보 이어야 한다. 이러한 수정 사항을 그대로 murine 중앙홀에 정확한 electrophysiological 평가 최적화 수 있습니다.
또한이 메서드는 몇 가지 제한이 있습니다. 첫째, 최대 공간 해상도 5 배 목표 렌즈를 사용 하는 아 트리 움의 한 부분에 국한 시야 (FOV) (즉.에 표시 된 그림 2a로 왼쪽된 심 방 돌출부). 아 트리 움의 더 큰 시야를 얻기위한, 1.6 X 목표 렌즈는 때로는 바람직합니다 (그림 2b). 둘째, 핀 안마당을 고정 하지 않고 가끔은 심 방 전도 속성을 올바르게 측정 하기 어려운 심 방 표면이 곡선 이기 때문에. 그래서, 우리는 핀으로 고정 하는 대신 그것을 버리고 그것의 표면에 커버 유리를 배치. 이 방법은 또한 솔루션의 진동에서 모션 아티팩트를 방지 하기 위한 도움이 됩니다. 셋째, 우리의 방법으로, 그것은 그것의 전체 FOV를 꽤 어려운 그래서, 앞쪽 및 후부 보기를 제대로 사용 하려면 그림 2와 같이 다른 접근 보다 우리의 접근 방식에 더 중요 하다. 이전 보기를 이용 병 적인 조건, 특히 돌출부 (그림 4)에 경우 재입국의 명확한 관찰 될 것 이다. 다른 한편으로, 후부 보기 심 방 후 벽의 좋은 볼을 얻기의 이점이 있다 고 트리거링 심근 소매 활동의 상세한 기록 될 수도 있습니다. 때 그것은 적절 한 보기를 얻을 우리의 방법으로 곡선된 표면 평평 어렵습니다, 아 트리 움 핀에 의해 최소한의 긴장으로 해결할 수 있습니다.
우리의 방법으로, 얼룩, 서 성, 그리고 부정맥 유도의 실패 3 가능한 문제 있다. 얼룩, 없는 경우의 오류에 대 한 또는 약간의 형광 관찰, 여부 광학 매핑 장치는 올바르게 조립, 그리고 시 적절 하 게 저장 및 사용 여부를 확인 해야 합니다. 관류 솔루션의 조건 또한 중요 한는 또한 자체, 그래서, pH, 온도를 포함 한 솔루션의 상태는 심장의 electrophysiological 속성 영향을 줄 수 이며 충분 한 통 기 통풍 엄격 하 게 모니터링 하는 여부. 그것은 또한 마음에 어떤 어 혈을 방지 하는 것이 중요입니다. 실패 속도 대 한 서 성 자극 아 트리 움, 흥분 수 없습니다 하는 경우 연구원은 확인 해야 배선 회로 시험기를 사용 하 여 정확한 인지 합니다. 서 성 자극은 올바르게 출력 하 고, 문제는 조직와 전극의 접촉 이다. 전극의 위치 문제를 해결할 수 있습니다 그리고 우리의 접근 서 성 카 테 터를 사용 하 여 쉽게. 부정맥 유도, 어려움에 대 한 계 서는 일부 제한 된 경우에는의 유도 대 한 사용할 수 있습니다. 원심 두 전극과 인접 전극 수에 위치할 RV 및 RA, 각각 quadripolar 전극 카 테 터를 사용 하 여, 그것은 쉽게 RV에 RA에서 서 성 사이트를 변경 하려면 이 카 테이 터 동시 심 실 활성화 신호 마스크 심 방 흥분 신호 때 이동 하는 심 실 흥분에도 유용 합니다.
이 방법은 기여할 것입니다 유전자 표현 형을 평가 하는 AF에서 상호 작용 관련 유전자 유전자는 다른 방법으로 그들을 표시 조사 실패에 대 한 특히 GWAS, 같은 소설 연구에 의해 새로 발견. 장치 및 기술 진보와 함께이 방법을 그대로 마음에 어20의 중요 한 소스는, 폐 정 맥 소매의 electrophysiological 속성을 평가 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 지원 프로그램에 의해 연구 환경 개선에 대 한 특별 조정 자금에서 젊은 연구자에 대 한 홍보 과학 및 기술 (SCF) (T.S.)를, 보조금에 대 한 과학적 연구 (제 16 K 09494, T.S., No. 26293052, T.F.)를 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 (MEXT) 일본의. 부탁 드립니다 Brainvision 및 씨 켄 지 Tsubokura 기술 지원에 대 한 그리고 우리는 또한 그의 언어 지원에 대 한 씨 존 마틴을 감사 드립니다.
(-)-Blebbistatin | SIGMA | B0560-1MG | E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping |
RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
Rhod2AM | Biotium | 50024 | Ca indicator |
Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Biotium | #59000 | To enhance the staining with Rhod2AM |
Di-4-ANEPPS | Wako | 041-29111 | Voltage-sensitive dye |
Dimethyl sulfoxide | Wako | 046-21981 | Solvent for reagents |
Bottle top filter | Corning | 430513 | For filtering Tyrode's solution |
Haparin Sodium | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd | N/A | To avoid blood clots in the coronary artery |
Air stone (φ8 mm x 10 mm) | Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho | N/A | for aeration |
Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku Corporation | N/A | For an anesthesia |
Programmable stimulator | Fukuda Denshi | BC-05 | Fukuda Denshi kindly rented us. |
Power Lab | AD Instruments | Powerlab 26/8SP | To record blood pressure and electrocardiogram |
Bio Amp | AD Instruments | ML132 | Amprifier for electrocardiogram |
BP Amp | AD Instruments | FE117 | Amprifier for blood pressure |
LabChart | AD Instruments | Version 7 | Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram |
Disposable BP transducer | AD Instruments | MLT0670 | pressure transducer |
1-Fr custom made electrode catheter | Unique Medical | N/A | To pace right atrium |
Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) | Natume Seisakujo | SP31 | Put into superior vena cava to introduce electrode catheter |
Millex-SV 5.00 μm | Merk Millipore | SLSV025LS | To filter the circulating Tyrode |
24-gauge indwelling needle | TERUMO | SR-FS2419 | Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber |
21-gauge needle | TERUMO | SN-2170 | We cut the tip of needle and blunted it by filing |
25-guage needle | TERUMO | NN-2525R | |
1-ml syringe | TERUMO | SS-01T | |
PVC tube | TERUMO | SF-ET0525 | for Langendorff's perfusion circuit |
Three-way stopcock | TERUMO | TS-TL2K | for Langendorff's perfusion circuit |
Petri dish | As one | 3-1491-01 | |
Custum made heating glass coil | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Custum made warming glass chamber | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Constant temperature circulating device | Lauda | E100 | connected to heating coil and warming chamber |
Cover glass (25 mm × 60 mm) | Matsunami | C025601 | Put on the atria to flatten the recording area |
Perista pump | ATTO | SJ-1211 | peristaltic pump |
Stemi DV4 | Carl Zeiss | N/A | Stereomicroscope |
MiCAM ULTIMA-L2 | Brainvision Inc. | UL-L2 | Optical mapping System |
BV_Ana Software | Brainvision Inc. | BV_Ana | Data Analysis Software |
THT Macroscope | Brainvision Inc. | THT-ZS | Epi-Illumination Unit |
LED Light Source | Brainvision Inc. | LEX2-G | |
Dichroic Mirror 560nm | Brainvision Inc. | DM560 | Epi-Illuminatinon |
Excitation Filter 520/35nm | Semrock, Inc. | FF01-520/35-25 | |
Projection lens Plan S 1.0X | Carl Zeiss | 435200-0000-000 | |
Focus Drive | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Objective lens Revolver | Carl Zeiss | 435302-0000-000 | |
Manual Focus Column | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Macroscope Base | Carl Zeiss | 435430-9901-000 | |
Straight Light Guide | MORITEX Corporation | MSG10-2200S | Epi-Illuminatinon |
Condenser Lens | MORITEX Corporation | ML-50 | |
PLANAPO 5.0X | Leica Microsystems | 10447243 | Objective Lens |
PLANAPO 1.0X | Leica Microsystems | 10447157 | Objective Lens |
PLANAPO 1.6X | Leica Microsystems | 10447050 | Objective Lens |
Beam-Splitter | Brainvision Inc. | FLSP-2 | |
Dichroic Mirror 665nm | Brainvision Inc. | DM665 | Beam-Splitter |
Emission Filter 572/28nm | Edmund Optics | #84-100 | Rhod2-AM |
Emission Filter 697/75nm | Semrock, Inc. | FF01-697/75-25 | RH237 and Di-4-ANEPPS |
0.2 mL PCR tube | Greiner Bio-One | 671201 | |
aluminum foil | Toyo alumi | 0020 |