胎盤におけるオートファジーの制御の母性的な肥満に関連付けられている炎症の影響を検討する主なひと胎盤絨毛細胞モデル
Summary
ここで紹介は一次電池文化のよりよくの分離に続いてひと胎盤絨毛組織のサンプリングのためのプロトコルです。Tnf α と絨毛トロホブ ラストの治療肥満の子宮内環境で炎症を繰り返すし、母性的な肥満と胎盤の炎症によって調整される分子標的の探索が容易になります。
Abstract
母性的な肥満では、オートファジーの調節不全に起因する妥協の胎盤機能によって仲介される可能性の高い周産期副作用のリスクの増加に関連付けられます。肥満妊娠から胎盤におけるオートファジー因子の発現の異常な変化は、肥満や妊娠に関連付けられている炎症性プロセスによって規制される可能性があります。ここで説明した絨毛組織のサンプリングの一次電池文化期のひと胎盤から絨毛よりよくの隔離のためのプロトコルです。腫瘍壊死因子アルファ (tnf α)、肥満と高架は炎症性サイトカインと無駄のない妊娠からプライマリ トロホブを扱うことによって肥満の子宮内環境で炎症性の環境をシミュレートするためのメソッドが続きます妊娠。ここで説明されているプロトコルの実装、外因性への曝露が分られる tnf α は、ルビコン、メスの胎児で無駄のない妊娠からトロホブにおけるオートファジーの負の調節因子の発現を調節します。肥満の子宮内環境の生物学的要因の様々 な維持トロホブで重要な経路を調節する可能性、この前のヴィヴォシステムは表現パターンを生体内で観察された場合を決定するために特に便利ひと胎盤母性的な肥満では、tnf α シグナルの直接の結果です。最終的には、このアプローチはオートファジーと他細胞クリティカルパスに影響を与える可能性のあるトロホブの母性的な肥満に関連付けられている炎症の規制および分子の影響を解析する機会を与える胎盤がある機能。
Introduction
肥満は、余分な脂肪と栄養アベイラビリティから生じる慢性的な軽度の炎症によって特徴付けられる炎症性状態です。肥満の循環で全身だけでなく、新陳代謝のティッシュの炎症性サイトカインが昇格されます。証拠の堅牢なボディは、tnf α は大幅上昇肥満の設定で意味を持つインスリン抵抗性と代謝不全1を示しています。Tnf α の活性化は、癌や自己免疫疾患、それに魅力的な治療上のターゲット2で病気の発症にもつながります。
妊娠、また炎症状態3,4によって肥満で炎症は悪化します。それは以前胎盤の tnf α のコンテンツがメスの胎児との妊娠の母体肥満と増加する示されています。さらに、tnf α の治療は、tnf α が性的に二形の方法5で胎盤の代謝の調節に関与していることを示唆している女性が、男性ではない栄養膜細胞のミトコンドリアの呼吸を阻害します。母性的な肥満は妊娠中、最も影響を受けやすい3,6,7,8 をされている男性の胎児の死産を含む様々 な合併症の発生率の増加に関連付けられています。.母体胎児のインターフェイスで、その重要な役割のため炎症性シグナル伝達への応答で肥満の子宮内環境で胎盤の機能の変化が肥満妊娠の結果を調停する際に重要な役割を再生可能性があります。
よくおよび胎盤の絨毛組織の syncytiotrophoblasts 内分泌シグナリングと母と発展途上の胎児9間栄養と酸素交換のため重要です。(以下、トロホブ) 絨毛よりよくの機能容量で中断が胎児の健康と開発を危険にさらします。このプロトコルでは、一次電池文化の絨毛トロホブ ラストの分離の最適化プロシージャと共に絨毛基底板を離れて解剖によるひと満期胎盤絨毛組織のサンプリング方法について説明します。このプロトコルはトロホブ10、を分離する差動密度遠心分離によって続いて細胞外マトリックスから細胞を解放する絨毛組織の酵素消化を含む確立された方法論から派生した11,12。このプロトコルの詳細は無駄のない妊娠から胎盤からプライマリ トロホブを扱われる炎症性の環境の 1 つのコンポーネントをシミュレートする tnf α を添加した培地でのアプローチは、母性的な肥満に関連付けられています。最後に、遺伝子発現の変化を検出するウエスタンブロット続いて tnf α 処理トロホブからの合計のセル lysates を収穫するための簡単な手順を説明します。
このモデルはそっくりそのまま子宮内環境 obesogenic を要約するだろうではない、tnf α を介した炎症トロホブの応答の個々 の貢献を解析することができます制御システムを提供します母性的な肥満。このモデルを発見したり、tnf α シグナル トロホブによる直接規制されている分子標的を確認、両方の機会を与えるだけでなく体内の母体と胎盤の遺伝子発現パターンの変化をテストすることができます。肥満では tnf α を介した炎症の可能性があります。
ここで説明している方法は、ひと培養トロホブ ラストにおけるオートファジーの調節における tnf α を介した炎症の影響をテストする実装されました。オスの胎児の展示と肥満妊娠からトロホブ中断オートファジーの回転、またはオートファゴソーム成熟13。ルビコン (実行ドメイン蛋白質相互作用の Beclin1 およびシステイン豊富なを含む)、後期エンドソーム、リソソームにローカライズされて、最近に記載されている「ブレーキ」として autophagic 回転プロセスに否定的なので、それと呼ばれるタンパク質オートファゴソーム成熟14,15のレギュレータ。実際には、ルビコン、貴重な治療上のターゲットとなるオートファジーを抑制するタンパク質のまれな例です。微生物16,17と心筋保護18に生得の免疫反応における役割を除いて、ルビコンの病態生理学的意義については、非常に小さな情報があり。ここで説明されているプロトコルを使用して、それはルビコンである tnf α の最大 250 pg/mL の濃度の増加と治療への反応で女性のプライマリ トロホブで亢進が見つかった。ルビコンの規制が役割を果たす女子胎児運賃に妊娠で男性より母性的な肥満と。肥満におけるクリティカルパスの導入規制子宮内環境の影響を検討するためのプラットフォームを提供します外因性 tnf α にひと培養トロホブ ラストを公開することによって前のヴィヴォ母性的な肥満に関連付けられている炎症をさたトロホブと胎盤の機能拡張。
Protocol
Representative Results
Discussion
胎盤は、胎児の成長を調整する責任は、肥満環境6で侵害された関数を展示します。絨毛トロホブ ラスト高の代謝要求にもかかわらず母性的な肥満と胎盤の機能不全のミトコンドリア呼吸6,19 を展示します。胎盤の代謝の変化合併症と肥満妊娠3,6,7で観察された?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、この研究のため、胎盤を寄付女性をありがとうございます。我々 も胎盤のコレクションを調整するため労働と配信部門大須母体と胎児の研究チームに感謝します。王博士は、エリックとケリー郭、MD にサポートに感謝して、実験方法と最適化を支援します。
NIH HD076259A (AM) によって資金が供給されたこの作品、AHA GRNT29960007 (AM)。
Materials
| 10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
| MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
| Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
| Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
| Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
| K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
| Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
| Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
| TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
| Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
| Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
| Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
| Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |
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