Un modèle trophoblastiques humaines primaires pour étudier l’effet de l’Inflammation associées à l’obésité maternelle sur la réglementation de l’autophagie dans le Placenta
Summary
Présenté ici est un protocole d’échantillonnage de tissus humains de villosités placentaires suivie d’isolement de cytotrophoblastes pour culture de cellules primaires. Traitement des trophoblastes avec TNFα récapitule l’inflammation dans l’environnement intra-utérin obèse et facilite la découverte de cibles moléculaires réglée par l’inflammation dans les placentas avec l’obésité maternelle.
Abstract
L’obésité maternelle est associée à un risque accru de complications périnatales qui sont vraisemblablement médiés par compromis fonction placentaire qui peut être attribuée, en partie, le dérèglement de l’autophagie. Aberrants changements dans l’expression des régulateurs de l’autophagie dans le placenta de grossesses obèses pourraient être régulés par des processus inflammatoires associées à l’obésité et la grossesse. Décrit ici est un protocole d’échantillonnage du tissu villeux et isolement des villeux cytotrophoblastes du placenta humain à terme pour culture de cellules primaires. Elle est suivie d’une méthode pour simuler le milieu inflammatoire dans l’environnement intra-utérin obèse en traitant les trophoblastes primaires de grossesses maigres avec le facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα), une cytokine pro-inflammatoire qui est élevé dans l’obésité, en grossesse. En mettant en œuvre le protocole décrit ici, il est constaté que l’exposition à exogène TNFα régule l’expression de Rubicon, un régulateur négatif de l’autophagie, trophoblastes de grossesses maigres avec des foetus féminins. Alors que divers facteurs biologiques dans l’environnement intra-utérin obèse maintenir la possibilité de moduler les voies critiques trophoblastes, ce système ex vivo est particulièrement utile pour déterminer si l’expression patterns observée in vivo dans des placentas humains souffrant d’obésité maternelle sont une conséquence directe de la signalisation de TNFα. En fin de compte, cette approche permet d’analyser les implications réglementaires et moléculaires de l’inflammation associées à l’obésité maternelle sur autophagie et autres voies cellulaires critiques dans les trophoblastes qui ont le potentiel d’influencer fonction placentaire.
Introduction
L’obésité est un état inflammatoire caractérisé par une inflammation chronique bas grade, découlant de l’excès de tissu adipeux et la disponibilité des nutriments. Dans l’obésité, cytokines pro-inflammatoires sont élevées dans les tissus métaboliques ainsi que systémique en circulation. Un corps robuste de la preuve a démontré que TNFα est significativement élevée dans le cadre de l’obésité avec des implications dans la résistance à l’insuline et le dysfonctionnement métabolique1. Activation du TNFα contribue également à la pathogenèse de la maladie dans des conditions telles que le cancer et l’auto-immunité, ce qui en fait une cible thérapeutique séduisante2.
L’inflammation dans l’obésité est aggravée par la grossesse, également, un état pro-inflammatoire3,4. Il a été précédemment démontré que contenu TNFα placentaire augmente avec adiposité maternelle lors de grossesses avec des foetus féminins. En outre, traitement de TNFα inhibe la respiration mitochondriale dans les cellules trophoblastiques femelle mais pas de mâles, ce qui suggère que le TNFα est impliqué dans la régulation du métabolisme placentaire dans une manière sexuellement dimorphes5. L’obésité maternelle est associée à l’augmentation de l’incidence de diverses complications pendant la grossesse, y compris la mortinatalité, avec des foetus mâles étant les plus sensibles3,6,7,8 . En raison de son rôle clé à l’interface materno-foetale, changements dans la capacité fonctionnelle du placenta dans l’environnement intra-utérin obèse en réponse à signalisation inflammatoires peuvent jouer un rôle important dans la médiation des textes issus de grossesses obèses.
Cytotrophoblastes et syncytiotrophoblasts dans le tissu villeux du placenta sont critiques pour la signalisation endocrinienne et échange de nutriments et d’oxygène entre la mère et le développement du foetus9. Perturbations dans la capacité fonctionnelle des villeux cytotrophoblastes (ci-après dénommé trophoblastes) peuvent compromettre la santé fœtale et le développement. Ce protocole décrit une méthode de prélèvement de tissu villeux du placenta humain à terme en disséquant loin les plaques chorioniques et basales ainsi qu’une procédure optimisée pour l’isolement des trophoblastes pour culture de cellules primaires. Ce protocole est dérivé des méthodes établies concernant la digestion enzymatique des villeux tissus pour libérer les cellules de la matrice extracellulaire, suivi par centrifugation à densité différentielle pour isoler les trophoblastes10, 11,,12. Détails de ce protocole une approche dans laquelle trophoblastes primaires de placentas de grossesses maigres sont traités avec des milieux de culture additionné de TNFα pour simuler une des composantes du milieu inflammatoire associée à l’obésité maternelle. Enfin, on décrit une méthode simple pour la récolte des lysats de cellules total de trophoblastes imprégnées de TNFα suivies par Western Blot pour détecter des modifications dans l’expression des gènes.
Ce modèle ne pas récapituler l’obésogènes in utero environnement dans son ensemble, mais il assure également un système de commande qui permet d’analyser la contribution individuelle de l’inflammation induite par le TNFα en réponse du trophoblaste à obésité maternelle. Ce modèle offre les deux l’occasion de découvrir ou de confirmer des cibles moléculaires directement réglementés par la signalisation de TNFα dans les trophoblastes ainsi que permet de tester si observé des changements dans les profils d’expression génique in vivo dans les placentas avec maternelle l’obésité peut être un résultat de l’inflammation induite par le TNFα.
L’approche décrite ici a été mis en place pour tester l’effet de l’inflammation induite par le TNFα sur la réglementation de l’autophagie dans le trophoblaste humain. Trophoblaste de grossesses obèses avec des foetus mâles pièce perturbée autophagique chiffre d’affaires, ou de maturation autophagosome13. Une protéine appelée Rubicon (RUN domaine protéine interagissant avec Beclin1 et riche en cystéine contenant), qui est localisé dans les lysosomes et les endosomes tardif, a été récemment décrit comme un « frein » dans le processus autophagique chiffre d’affaires car il fonctionne comme un négatif régulateur de l’autophagosome maturation14,15. En fait, le Rubicon est un rare exemple d’une protéine qui retient l’autophagie, ce qui en fait une cible thérapeutique précieuse. Il existe très peu d’informations sur l’importance pathophysiologique de Rubicon, à l’exception de son rôle dans la réponse immunitaire innée à16,17 et cardiomyocyte protection produits microbiens18. Utilisant le protocole décrit ici, on trouve que le Rubicon est positivement en femelles trophoblastes primaires en réponse à un traitement avec des concentrations croissantes de TNFα jusqu’à 250 pg/mL. La régulation du Rubicon peut jouer un rôle dans Comment femelle foetus tarifs mieux que les hommes dans les grossesses avec l’obésité maternelle. Récapitulant l’inflammation associées à l’obésité maternelle ex vivo en exposant les trophoblastes humaines à TNFα exogène fournit une plate-forme pour étudier l’impact de l’environnement intra-utérin obèse sur la régulation des voies critiques dans trophoblaste et, par extension, la fonction placentaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le placenta, responsable de la régulation de la croissance du fœtus, pièces fonction fragilisée dans l’ environnement obèses6. Malgré la forte demande métabolique des trophoblastes, placentas avec l’obésité maternelle pièce dysfonctionnelle de la respiration mitochondriale6,19. Changements dans le métabolisme placentaire peuvent contribuer à l’augmentation de l’incidence des complications et des complications foetales obs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient les femmes qui ont fait don de leur placenta pour cette étude. Nous remercions également le travail et le service de livraison au OHSU et la maternelle et fœtale recherche équipe pour coordonner la collecte des placentas. Nous sommes reconnaissants à Eric Wang, Ph.d. et Kelly Kuo, MD pour la prise en charge et aider avec les méthodes expérimentales et optimisation.
Ce travail a été financé par le NIH HD076259A (AM) et AHA GRNT29960007 (AM).
Materials
| 10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
| MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
| Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
| Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
| Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
| K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
| Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
| Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
| TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
| Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
| Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
| Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
| Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |
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