Eine primäre menschlichen Trophoblast-Modell, die Wirkung der Entzündung mit mütterlichen Fettleibigkeit auf Verordnung der Autophagie in der Plazenta zu studieren
Summary
Hier ist ein Protokoll für die Probenahme der menschlichen Plazenta Zotten Gewebe gefolgt von Isolation der Cytotrophoblasts für die primäre Zellkultur. Behandlung von Trophoblasten mit TNF rekapituliert Entzündung in der übergewichtigen intrauterine Umwelt und ermöglicht die Entdeckung von molekularen Zielstrukturen, geregelt durch eine Entzündung in der Plazenta mit mütterliche Korpulenz.
Abstract
Mütterliche Korpulenz ist verbunden mit einem erhöhten Risiko von nachteiligen perinatale Ergebnisse, die wahrscheinlich durch kompromittierte plazentaren Funktion vermittelt werden, die, im Teil, die Dysregulation der Autophagie zugeschrieben werden kann. Anomale Veränderungen in der Expression der Autophagie Regulatoren in der Plazenta von adipösen Schwangerschaften können durch entzündliche Prozesse im Zusammenhang mit Übergewicht und Schwangerschaft geregelt werden. Hier beschrieben, ist ein Protokoll zur Probenahme von Zotten Gewebe und Isolierung von Zotten Cytotrophoblasts aus der Begriff menschlichen Plazenta für primären Zellkulturen. Danach erfolgt eine Methode zur Simulation der entzündlichen Milieus in der übergewichtigen intrauterine Umwelt durch Behandlung von primären Trophoblasten von schlanken Schwangerschaften mit Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF), ein proinflammatorischen Zytokin, das bei Adipositas und in erhöht ist Schwangerschaft. Durch die Umsetzung des Protokolls, die hier beschrieben, es wird gefunden, dass Exposition gegenüber exogenen TNF reguliert die Expression von Rubicon, ein negativer Regulator der Autophagie in Trophoblasten von schlanken Schwangerschaften mit weiblichen Föten. Während eine Vielzahl von biologischen Faktoren in der übergewichtigen intrauterine Umwelt halten das Potenzial, kritische Pfade im Trophoblasten modulieren, ist dieses ex-Vivo -System besonders nützlich für die Bestimmung, wenn Ausdruck beobachteten in Vivo Muster im menschlichen Plazenta mit mütterliche Adipositas sind ein direktes Ergebnis von TNF-Signalisierung. Letztlich bietet dieser Ansatz die Gelegenheit, analysieren die Regulierungs- und molekularen Auswirkungen der Entzündung mit mütterlichen Fettleibigkeit auf Autophagie und andere kritische zelluläre Signalwege im Trophoblasten, die das Potenzial haben, beeinflussen plazentare Funktion.
Introduction
Adipositas ist eine entzündliche Zustand, gekennzeichnet durch eine chronische Entzündung der Low-Grade, aus überschüssigem Fettgewebe und Nährstoffverfügbarkeit. Bei Adipositas sind proinflammatorischen Zytokinen in metabolische Geweben sowie systemisch im Umlauf erhöht. Ein robusten Körper des Beweises hat gezeigt, dass TNF deutlich in der Umgebung von Fettleibigkeit mit Auswirkungen in Insulin-Resistenz und Stoffwechselstörungen1erhöht ist. Aktivierung von TNF trägt auch zur Pathogenese der Krankheit bei Krankheiten wie Krebs und Autoimmunität, so dass es eine attraktive therapeutisches Ziel2.
Entzündungen bei Adipositas wird durch Schwangerschaft, auch ein proinflammatorischen Zustand3,4verschärft. Es hat bisher gezeigt, dass Plazenta TNF-Inhalte mit mütterliche Adipositas bei Schwangerschaften mit weiblichen Föten erhöht. Darüber hinaus hemmt TNF Behandlung mitochondriale Atmung in weiblichen aber nicht männlichen Trophoblast Zellen, was darauf hindeutet, dass TNF beteiligt ist, bei der Regulierung der plazentaren Stoffwechsel in einem sexuell dimorphen Weise5. Mütterliche Korpulenz ist verbunden mit einer erhöhten Inzidenz von einer Vielzahl von Komplikationen während der Schwangerschaft, einschließlich Totgeburt, mit männlichen Föten wird das empfindlilchste3,6,7,8 . Aufgrund seiner Schlüsselrolle an der mütterlichen fetalen Schnittstelle können Veränderungen in der Funktionsfähigkeit der Plazenta in der übergewichtigen intrauterine Umwelt in Reaktion auf inflammatorische Signalisierung eine wichtige Rolle bei der Vermittlung der Ergebnisse der übergewichtigen Schwangerschaften spielen.
Cytotrophoblasts und Syncytiotrophoblasts im Gewebe der Plazenta Zotten sind entscheidend für die endokrine Signalisierung und Nährstoff- und Sauerstoff-Austausch zwischen Mutter und entwickelnden Fötus9. Störungen in der funktionellen Kapazität der Zotten Cytotrophoblasts (nachfolgend Trophoblasten) können die fötale Gesundheit und Entwicklung gefährden. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Probenahme von Zotten Gewebe aus der Plazenta menschlichen Begriff durch sezieren entfernt die Chorion und basale Platte sowie ein optimiertes Verfahren zur Isolierung von Trophoblasten für primären Zellkulturen. Dieses Protokoll stammt von etablierten Methoden mit enzymatischen Verdauung der Zotten Gewebe, Zellen aus der extrazellulären Matrix, gefolgt von differenziellen Dichte Zentrifugation Trophoblasten10, isolieren lassen 11,12. Dieser Protokolldetails ein Ansatz in der primären Trophoblasten von Plazenta aus magerem Schwangerschaften mit Nährmedien ergänzt mit TNF, ein Bestandteil der entzündlichen Milieu zu simulieren behandelt werden mit mütterliche Korpulenz verbunden sind. Schließlich wird ein einfaches Verfahren für die Ernte Ergebniszelle Lysates von TNF-behandelten Trophoblasten gefolgt von Western Blot zum Erkennen von Änderungen in der Genexpression beschrieben.
Während dieses Modell nicht die adipogene in Utero Umwelt in ihrer Gesamtheit rekapitulieren, bietet es ein kontrolliertes System, das es erlaubt, analysieren, der individuelle Beitrag von TNF-vermittelte Entzündung der Trophoblasten als Reaktion auf mütterliche Korpulenz. Dieses Modell bietet sowohl die Möglichkeit zu entdecken oder zu bestätigen molekulare Targets direkt TNF signalisieren in den Trophoblasten geregelt sowie kann man testen, ob Veränderungen im gen Expressionsmuster in Vivo in Plazenta mit Müttern beobachtet Fettleibigkeit kann TNF-vermittelte Entzündung führen.
Der hier beschriebene Ansatz wurde implementiert, um die Wirkung von TNF-vermittelte Entzündung über die Regulierung der Autophagie in menschlichen Trophoblasten zu testen. Trophoblasten von adipösen Schwangerschaften mit männlichen Föten Ausstellung gestört selbstverdauende Umsatz oder Autophagosome Reifung13. Ein Protein namens Rubicon (RUN Domain Protein Beclin1 Interaktion und Cystein-reiche enthält), die zum späten Endosomen und Lysosomen lokalisiert ist, hat vor kurzem beschrieben worden als “Bremse” selbstverdauende Umsatz dabei da er fungiert als eine negative Regulator der Autophagosome Reifung14,15. Rubicon ist in der Tat ein seltenes Beispiel eines Proteins, die Autophagie, zurückhält, wodurch es eine wertvolle therapeutische Ziel. Sehr wenig Informationen gibt es über die pathophysiologische Bedeutung der Rubicon, außer für seine Rolle in der angeborenen Immunantwort auf Microbials16,17 und Cardiomyocyte Schutz18. Mit dem beschriebenen Protokoll hier, wird es festgestellt, dass Rubicon hochreguliert in weiblichen primären Trophoblasten in Reaktion auf die Behandlung mit steigenden Konzentrationen von TNF bis 250 Pg/mL. Die Regulierung der Rubicon kann eine Rolle in wie weibliche Föten Tarif besser als Männer in den Schwangerschaften mit mütterliche Korpulenz spielen. Rekapitulation Entzündung mit mütterliche Korpulenz ex Vivo durch die Aufdeckung der menschlichen Trophoblasten, exogene TNF bietet eine Plattform zur Untersuchung der Auswirkungen der übergewichtigen intrauterine Umwelt zur Regulierung von kritischen Pfaden in Trophoblasten und durch Verlängerung, plazentare Funktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Plazenta, verantwortlich für die Regulierung des Wachstums des Fötus, weist auf kompromittierten Funktion in der übergewichtigen Umwelt6. Trotz der hohen metabolischen Anforderungen des Trophoblasten weisen Plazenta mit mütterliche Korpulenz dysfunktionalen mitochondriale Atmung6,19. Veränderungen im Stoffwechsel der Plazenta können zu erhöhten Inzidenz von Komplikationen und unerwünschten fetalen Ergebnisse beobachtet in fettl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Frauen, die ihre Plazenta für diese Studie gespendet. Wir danken auch die Arbeit und Lieferung Abteilung OHSU mütterliche und fetale Research-Team für die Koordinierung der Sammlung der Plazenta. Wir sind dankbar für Eric Wang, Ph.d., und Kelly Kuo, MD für Unterstützung und helfen mit experimentellen Methoden und Optimierung.
Diese Arbeit wurde finanziert vom NIH HD076259A (morgens) und AHA GRNT29960007 (morgens).
Materials
| 10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
| MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
| Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
| Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
| Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
| K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
| Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
| Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
| TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
| Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
| Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
| Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
| Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |
References
- Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).
- van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).
- Yogev, Y., Catalano, P. M. Pregnancy and obesity. Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 36 (2), 285-300 (2009).
- Basu, S., et al. Pregravid obesity associates with increased maternal endotoxemia and metabolic inflammation. Obesity (Silver Spring). 19 (3), 476-482 (2011).
- Muralimanoharan, S., Guo, C., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in miR-210 expression and mitochondrial dysfunction in the placenta with maternal obesity. Int J Obes (Lond). 39 (8), 1274-1281 (2015).
- Myatt, L., Maloyan, A. Obesity and placental function. Semin. Reprod. Med. 34 (1), 42-49 (2016).
- Aune, D., Saugstad, O. D., Henriksen, T., Tonstad, S. Maternal body mass index and the risk of fetal death, stillbirth, and infant death: a systematic review and meta-analysis. JAMA. 311 (15), 1536-1546 (2014).
- Eriksson, J. G., Kajantie, E., Osmond, C., Thornburg, K., Barker, D. J. P. Boys live dangerously in the womb. Am. J. Hum. Biol. 22 (3), 330-335 (2010).
- Kliman, H. J., Knobil, E., Neill, J. D. Trophoblast to human placenta. Enc. Reprod. 4, 834-846 (1999).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
- Bax, C. M., et al. Ultrastructural changes and immunocytochemical analysis of human placental trophoblast during short-term culture. Placenta. 10 (2), 179-194 (1989).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells’ calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
- Muralimanoharan, S., Gao, X., Weintraub, S., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in activation of placental autophagy in obese women with evidence for fetal programming from a placenta-specific mouse model. Autophagy. 12 (5), 752-769 (2016).
- Matsunaga, K., et al. Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 385-396 (2009).
- Zhong, Y., et al. Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 468-476 (2009).
- Yang, C. -. S., et al. Autophagy Protein Rubicon Mediates Phagocytic NADPH Oxidase Activation in Response to Microbial Infection or TLR Stimulation. Cell Host & Microbe. 11 (3), 264-276 (2012).
- Yang, C. -. S., et al. The Autophagy Regulator Rubicon Is a Feedback Inhibitor of CARD9-Mediated Host Innate Immunity. Cell Host & Microbe. 11 (3), 277-289 (2012).
- Zi, Z., et al. Rubicon deficiency enhances cardiac autophagy and protects mice from lipopolysaccharide-induced lethality and reduction in stroke volume. J. Cardiovasc. Pharmacol. 65 (3), 252-261 (2015).
- Mele, J., Muralimanoharan, S., Maloyan, A., Myatt, L. Impaired mitochondrial function in human placenta with increased maternal adiposity. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 307 (5), E419-E425 (2014).
- Mor, G., Cardenas, I., Abrahams, V., Guller, S. Inflammation and pregnancy: the role of the immune system at the implantation site. Ann N Y Acad Sci. 1221 (1), 80-87 (2011).
- Resi, V., et al. Molecular inflammation and adipose tissue matrix remodeling precede physiological adaptations to pregnancy. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 303 (7), E832-E840 (2012).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
- Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10 (5), 461-470 (2009).
- Sagrillo-Fagundes, L., et al. Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption. JoVE. (113), (2016).
- Segovia, S. A., Vickers, M. H., Gray, C., Reynolds, C. M. Maternal obesity, inflammation, and developmental programming. Biomed. Res. Int. , 418975 (2014).
- Komatsu, M., et al. Tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR. Clin. Chem. 47 (7), 1297-1301 (2001).
- Matsunaga, K., Noda, T., Yoshimori, T. Binding Rubicon to cross the Rubicon. Autophagy. 5 (6), 876-877 (2009).
