Plasenta Autophagy düzenlenmesi üzerinde anne obezite ile ilişkili iltihap etkisini incelemek için bir birincil insan Trofoblast modeli
Summary
Burada sunulan örnekleme cytotrophoblasts birincil hücre kültürü için yalıtım ardından insan plasental villous dokusunun bir protokoldür. Trophoblasts ile TNFα tedavisinde iltihabı obez intrauterin ortamda beyannamedir ve moleküler hedeflerin plasenta iltihabı ile anne obezite sahiplenilip keşfi kolaylaştırır.
Abstract
Anne obezite, kısmen, autophagy bozukluk bağlanabilir güvenliği aşılan plasental işlevi tarafından büyük olasılıkla aracılı olumsuz perinatal sonuçlar riski ile ilişkilidir. Plasenta obez gebelik üzerinden autophagy düzenleyiciler ifadesi anormal değişiklikleri obezite ve gebelik ile ilgili inflamatuar işlemler tarafından düzenlenmiş olabilir. Burada açıklanan örnekleme villous doku ve dönem insan plasenta birincil hücre kültürü için gelen villous cytotrophoblasts yalıtım için bir protokoldür. Bu tümör nekrozis faktör alfa (TNFα), obezite ve içinde yüksek bir proinflamatuar sitokin ile yalın gebelik gelen birincil trophoblasts tedavisi ile obez intrauterin ortam inflamatuar ortamda simülasyonu için bir yöntem izliyor gebelik. Burada açıklanan protokol uygulanması, bu maruz kalma eksojen bulunursa TNFα düzenleyen Rubicon, autophagy, trophoblasts kadın rehinenin çeşitli hastalıkları ile yalın gebelik gelen olumsuz bir regülatör ifadesidir. Biyolojik faktörleri obez intrauterin ortamında çeşitli korumak trophoblasts kritik yollar modüle potansiyeline, bu ex vivo sistem vivo içinde gözlenen ifade desenleri belirlemek için özellikle yararlı iken insan plasenta anne obezite ile TNFα sinyal doğrudan bir sonucu vardır. Sonuçta, bu yaklaşım dışarı autophagy ve etki potansiyeline sahip trophoblasts diğer kritik hücresel yollar anne obezite ile ilişkili iltihap düzenleyici ve moleküler etkileri ayrıştırmak için fırsat tanıyor plasental fonksiyon.
Introduction
Obezite, aşırı yağ dokusu ve besin kullanılabilirlik kaynaklanan kronik düşük dereceli inflamasyonu ile karakterize enflamatuar bir durumdur. Obezite, proinflamatuar sitokinler metabolik doku yanı sıra sistemik dolaşıma yüksek. Kanıt sağlam bir gövdesi TNFα önemli ölçüde obezite ayarında kaygıları ile insülin direnci ve metabolik fonksiyon bozukluğu1yükselmiş olduğunu göstermiştir. TNFα aktivasyonu da kanser ve otoimmünite, yapım o bir çekici terapötik hedef2gibi koşulları hastalık patogenezinde katkıda bulunur.
Obezite iltihap gebelik, bir proinflamatuar devlet43,aynı zamanda tarafından bileşik olduğunu. Daha önce plasental TNFα içeriği gebelik kadın rehinenin çeşitli hastalıkları ile anne obezite ile artar gösterilmiştir. Ayrıca, TNFα tedavi kadın ama değil erkek Trofoblast hücrelerde mitokondrial solunum TNFα cinsel dimorfik şekilde5plasental metabolizmasında düzenlenmesinde ilgilenmektedir düşündüren engeller. Anne obezite distres, erkek fetusa en duyarlı3,6,7,8 olmak dahil gebelikte komplikasyon çeşitli artan insidansı ile ilişkilidir . Maternal-fetal arayüzü anahtar rolü nedeniyle, plasenta inflamatuar sinyal karşılık obez intrauterin ortamda fonksiyonel kapasite değişimler obez gebelik sonuçlarını arabuluculuk önemli bir rol oynayabilir.
Cytotrophoblasts ve syncytiotrophoblasts plasenta villous doku endokrin sinyal ve anne ve gelişmekte olan fetus9arasındaki besin ve oksijen alışverişi için önemlidir. Fonksiyonel kapasite aksamalar villous cytotrophoblasts (bundan sonra trophoblasts anılacaktır), fetal sağlık ve gelişme tehlikeye. Bu iletişim kuralı uzak chorionic ve Bazal plakayı trophoblasts birincil hücre kültürü için yalıtım için en iyi duruma getirilmiş bir prosedür ile birlikte anatomi tarafından villous insan terim plasenta dokudan örnekleme için bir yöntem açıklar. Bu iletişim kuralı kurulan yöntemleri Enzimatik sindirim trophoblasts10, izole etmek için farklı yoğunluk Santrifüjü tarafından takip hücre dışı matriks hücrelerinden serbest bırakmak için villous doku içeren türetilir 11,12. Yalın gebeliklerde plasenta gelen birincil trophoblasts kültür TNFα ile inflamatuar ortamın bir bileşeni benzetimini yapmak için desteklenen medya ile kabul edilir bir yaklaşım anne obezite ile ilişkili olan bu protokolü ayrıntıları. Son olarak, toplam hücresini lysates TNFα tedavi trophoblasts gen ifadesinde değişiklikleri algılamak için kurutma Western ardından gelen hasat için basit bir yordam açıklanır.
Bu model obesogenic rahim içinde çevre bütünüyle özetlemek değil iken, bir bireysel katkı TNFα aracılı inflamasyon trophoblasts yanıt olarak dışarı ayrıştırmak veren kontrollü bir sistem sağlar Anne obezite. Bu model keşfetmek veya moleküler hedefler doğrudan TNFα trophoblasts içinde sinyal tarafından düzenlenir onaylamak için hem fırsat tanıyor hem de bir gen ifade şekillerindeki değişiklikleri vivo içinde plasenta anne ile içinde gözlenen Eğer test etmek izin verir Obezite TNFα aracılı inflamasyon sonucu olabilir.
Burada açıklanan yaklaşım TNFα aracılı inflamasyon etkisi autophagy düzenlenmesinde insan trophoblasts test etmek için kullanılmıştır. Erkek fetusa sergi ile obez gebelik trophoblasts alt üst autophagic ciro veya autophagosome olgunlaşma13. Organellerin ve geç endosomes için yerelleştirilmiş, çünkü o bir negatif görev son zamanlarda bir “fren” autophagic ciro işlemi tarif edilmiştir (Çalıştır etki alanını, protein Beclin1 etkileşim ve sistein-zengin içeren), Rubicon adlı bir protein Regülatör autophagosome olgunlaşma14,15. Aslında, Rubicon bu değerli terapötik hedef yapıyor autophagy kısıtlayan bir protein nadir bir örnektir. Rubicon, patofizyolojik önemi mikroplara16,17 ve cardiomyocyte koruma18doğuştan gelen bağışıklık yanıtındaki rolleri dışında hakkında çok az bilgi mevcuttur. Burada açıklanan protokolü kullanarak, Rubicon TNFα konsantrasyonları 250 pg/mL kadar artan ile tedaviye yanıt kadın birincil trophoblasts upregulated’s bulunur. Gebelik erkeklerde daha iyi Rubicon düzenlenmesi bir rol nasıl kadın fetusa fare anne obezite ile oynayabilir. Eksojen TNFα için insan trophoblasts açarak anne obezite ex vivo ile ilişkili iltihap recapitulating obez intrauterin ortam üzerinde kritik yollar düzenlemenin etkisi çalışma için bir platform sağlar trophoblasts ve dolayısıyla, plasental fonksiyon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Plasenta, fetus, büyüme düzenleyen sorumlu obez environment6güvenliği aşılan işlevinde sergiler. Trophoblasts yüksek metabolik talep rağmen plasenta anne obezite ile işlevsiz mitokondrial solunum6,19sergi. Plasental metabolizma değişiklikleri komplikasyonlar ve advers fetal sonuçları obez gebelik3,6,7‘ gözlenen olaylarının artmas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar bu çalışma için onların plasenta hibe kadınlar teşekkür ederiz. Biz de emek ve teslim bölümü OHSU ve Maternal ve Fetal araştırma ekibi plasenta topluluğu koordinasyon için teşekkür ederim. Biz destek için Eric Wang, doktora ve Kelly Kuo, MD için minnettar ve deneysel yöntemleri ve optimizasyonu ile yardımcı olur.
Bu eser NIH HD076259A (AM) tarafından finanse edildi ve AHA GRNT29960007 (AM).
Materials
| 10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
| MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
| Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
| Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
| Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
| K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
| Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
| Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
| TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
| Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
| Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
| Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
| Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |
References
- Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).
- van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).
- Yogev, Y., Catalano, P. M. Pregnancy and obesity. Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 36 (2), 285-300 (2009).
- Basu, S., et al. Pregravid obesity associates with increased maternal endotoxemia and metabolic inflammation. Obesity (Silver Spring). 19 (3), 476-482 (2011).
- Muralimanoharan, S., Guo, C., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in miR-210 expression and mitochondrial dysfunction in the placenta with maternal obesity. Int J Obes (Lond). 39 (8), 1274-1281 (2015).
- Myatt, L., Maloyan, A. Obesity and placental function. Semin. Reprod. Med. 34 (1), 42-49 (2016).
- Aune, D., Saugstad, O. D., Henriksen, T., Tonstad, S. Maternal body mass index and the risk of fetal death, stillbirth, and infant death: a systematic review and meta-analysis. JAMA. 311 (15), 1536-1546 (2014).
- Eriksson, J. G., Kajantie, E., Osmond, C., Thornburg, K., Barker, D. J. P. Boys live dangerously in the womb. Am. J. Hum. Biol. 22 (3), 330-335 (2010).
- Kliman, H. J., Knobil, E., Neill, J. D. Trophoblast to human placenta. Enc. Reprod. 4, 834-846 (1999).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
- Bax, C. M., et al. Ultrastructural changes and immunocytochemical analysis of human placental trophoblast during short-term culture. Placenta. 10 (2), 179-194 (1989).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells’ calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
- Muralimanoharan, S., Gao, X., Weintraub, S., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in activation of placental autophagy in obese women with evidence for fetal programming from a placenta-specific mouse model. Autophagy. 12 (5), 752-769 (2016).
- Matsunaga, K., et al. Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 385-396 (2009).
- Zhong, Y., et al. Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 468-476 (2009).
- Yang, C. -. S., et al. Autophagy Protein Rubicon Mediates Phagocytic NADPH Oxidase Activation in Response to Microbial Infection or TLR Stimulation. Cell Host & Microbe. 11 (3), 264-276 (2012).
- Yang, C. -. S., et al. The Autophagy Regulator Rubicon Is a Feedback Inhibitor of CARD9-Mediated Host Innate Immunity. Cell Host & Microbe. 11 (3), 277-289 (2012).
- Zi, Z., et al. Rubicon deficiency enhances cardiac autophagy and protects mice from lipopolysaccharide-induced lethality and reduction in stroke volume. J. Cardiovasc. Pharmacol. 65 (3), 252-261 (2015).
- Mele, J., Muralimanoharan, S., Maloyan, A., Myatt, L. Impaired mitochondrial function in human placenta with increased maternal adiposity. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 307 (5), E419-E425 (2014).
- Mor, G., Cardenas, I., Abrahams, V., Guller, S. Inflammation and pregnancy: the role of the immune system at the implantation site. Ann N Y Acad Sci. 1221 (1), 80-87 (2011).
- Resi, V., et al. Molecular inflammation and adipose tissue matrix remodeling precede physiological adaptations to pregnancy. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 303 (7), E832-E840 (2012).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
- Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10 (5), 461-470 (2009).
- Sagrillo-Fagundes, L., et al. Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption. JoVE. (113), (2016).
- Segovia, S. A., Vickers, M. H., Gray, C., Reynolds, C. M. Maternal obesity, inflammation, and developmental programming. Biomed. Res. Int. , 418975 (2014).
- Komatsu, M., et al. Tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR. Clin. Chem. 47 (7), 1297-1301 (2001).
- Matsunaga, K., Noda, T., Yoshimori, T. Binding Rubicon to cross the Rubicon. Autophagy. 5 (6), 876-877 (2009).
