En primær menneskelige Trophoblast modell å studere effekten av betennelse forbundet med mors overvekt på regulering av Autophagy i morkaken
Summary
Presenteres her er en protokoll for prøvetaking av menneskelig placental villous vev etterfulgt av isolering av cytotrophoblasts for primær cellekultur. Behandling av trophoblasts med TNFα viser betennelse i overvektige intrauterine miljøet og Letter oppdagelsen av molekylære mål regulert av betennelse i placentas med mors fedme.
Abstract
Mors overvekt er assosiert med økt risiko for uønskede perinatal resultater som er sannsynlig formidlet av kompromittert placental funksjon som kan tilskrives, delvis feilregulering av autophagy. Avvikende endringer i uttrykket av autophagy regulatorer i placentas fra overvektige svangerskap kan reguleres av inflammatoriske prosesser knyttet til både fedme og graviditet. Beskrevet her er en protokoll for prøvetaking av villous vev og isolering av villous cytotrophoblasts fra begrepet menneskelige morkaken for primær cellekultur. Dette etterfølges av en metode for å simulere inflammatorisk miljøet i overvektige intrauterine miljøet ved å behandle primære trophoblasts fra lean svangerskap med tumor nekrose faktor alpha (TNFα), en proinflammatory cytokin det er opphøyet i fedme og graviditet. Gjennom implementeringen av protokollen beskrevet her, er det funnet at eksponering for eksogene TNFα regulerer uttrykk for Rubicon, en negativ regulator av autophagy, i trophoblasts fra lean svangerskap med kvinnelige fostre. Mens en rekke biologiske faktorer i overvektige intrauterine miljøet opprettholde potensial til å modulere kritiske stier i trophoblasts, er ex vivo systemet spesielt nyttig for å avgjøre hvis uttrykket mønstre observert i vivo i menneskelig placentas med mors overvekt er et direkte resultat av TNFα signalering. Til slutt denne tilnærmingen gir oss mulighet til å analysere regulatoriske og molekylære implikasjoner av betennelse forbundet med mors overvekt på autophagy og andre kritiske cellulære veier i trophoblasts som har potensial til å påvirke placental funksjon.
Introduction
Fedme er en inflammatorisk tilstand preget av kronisk lav-grade betennelse, stammer fra overflødig fettvev og næringsstoffer tilgjengelighet. I fedme, er proinflammatory cytokiner opphøyet i metabolske vev og systemisk i sirkulasjon. En robust kropp av bevis har vist at TNFα er betydelig hevet i innstillingen av fedme med implikasjoner i insulinresistens og metabolske dysfunksjon1. Aktivering av TNFα bidrar også til sykdom patogenesen i forhold som kreft og autoimmunitet, noe som gjør det til et attraktivt terapeutisk mål2.
Betennelse i fedme er forsterket av graviditet, også en proinflammatory tilstand3,4. Det har tidligere vist at placental TNFα innhold øker med mors lokalisert fedme i svangerskap med kvinnelige fostre. Videre hemmer TNFα behandling mitokondrie åndedrett i kvinnelige men ikke mannlige trophoblast celler, noe som tyder på at TNFα er involvert i å regulere placental stoffskiftet i en dekket av hvit måte5. Mors overvekt er assosiert med økt forekomst av en rekke komplikasjoner i svangerskapet, inkludert dødfødsel, med mannlige fostre er mest utsatt3,6,7,8 . På grunn av sin nøkkelrolle på mødre fosterets grensesnittet, kan endringer i den funksjonelle kapasiteten til placenta hos overvektige intrauterine miljøet svar på inflammatorisk signalering spille en viktig rolle i formidle resultatene av overvektige svangerskap.
Cytotrophoblasts og syncytiotrophoblasts i villous vev av morkaken er avgjørende for endokrine signalering og næringsstoffer og oksygen utveksling mellom mor og utvikle fosteret9. Forstyrrelser i den funksjonelle kapasiteten av villous cytotrophoblasts (heretter referert til som trophoblasts) kan sette fosterets helse og utvikling. Denne protokollen beskriver en metode for prøvetaking av villous human frist morkaken av dissecting unna chorion og basal platene med en optimalisert prosedyre for isolering av trophoblasts for primær cellekultur. Denne protokollen er utledet fra etablerte metoder som involverer enzymatisk fordøyelsen av villous vev å løslate celler fra den ekstracellulære matrisen etterfulgt av differensial tetthet sentrifugering isolere trophoblasts10, 11,12. Denne protokollen detaljer tilnærming som primær trophoblasts fra placentas fra lean svangerskap er behandlet med kultur medier med TNFα å simulere en del av inflammatoriske miljøet forbundet med mors overvekt. Endelig, en enkel prosedyre for høsting total-celle lysates fra TNFα-behandlet trophoblasts etterfulgt av Western blotting for å registrere endringer i genuttrykk er beskrevet.
Mens denne modellen ikke er recapitulate obesogenic i utero miljøet i sin helhet, gir det et kontrollert system som gjør det mulig å sortere ut de enkelte bidrag av TNFα-mediert betennelse trophoblasts’ svar mors overvekt. Denne modellen gir både muligheten til å oppdage eller bekrefte molekylære mål direkte regulert av TNFα signalering i trophoblasts som gjør det mulig å teste om endringer i gene expression mønstre observert i vivo i placentas med mors fedme kan være et resultat av TNFα-mediert betennelse.
Fremgangsmåten beskrevet her ble gjennomført for å teste effekten av TNFα-mediert betennelse på regulering av autophagy i menneskelig trophoblasts. Trophoblasts fra overvektige svangerskap med mannlige fostre utstillingen forstyrret autophagic omsetning eller autophagosome modning13. Et protein som kalles Rubicon (Kjør domene protein Beclin1 samspill og cystein-rik inneholder), som er lokalisert til lysosomer og sene endosomes, har blitt nylig beskrevet som en “håndbrekket” i autophagic omsetning prosessen fordi det fungerer som en negativ regulator autophagosome modning14,15. Rubicon er faktisk et sjeldent eksempel på en protein som begrenser autophagy, som gjør det en verdifull terapeutisk mål. Svært lite informasjon er tilgjengelig om patofysiologiske betydningen av Rubicon, bortsett fra dens roller i medfødte immunforsvaret til microbials16,17 og cardiomyocyte beskyttelse18. Ved hjelp av protokollen som er beskrevet her, er det funnet at Rubicon er upregulated i kvinnelige primære trophoblasts i respons på behandling med økende konsentrasjoner av TNFα opp til 250 pg/mL. Regulering av Rubicon kan spille en rolle i hvordan kvinner fostre billettpris bedre enn menn i svangerskap med mors fedme. Recapitulating betennelse forbundet med mors overvekt ex vivo ved å utsette menneskelige trophoblasts til eksogene TNFα gir en plattform for å studere virkningen av overvektige intrauterine miljøet på regulering av kritiske stier i trophoblasts og dermed placental funksjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Morkaken, ansvarlig for å regulere vekst av fosteret, utstillinger kompromittert funksjon i overvektige miljø6. Til tross for høye metabolsk krav trophoblasts utstilling placentas med mors overvekt dysfunksjonelle mitokondrie åndedrett6,19. Endringer i placental metabolisme kan bidra til økt forekomsten av komplikasjoner og uønskede fetal resultater i overvektige svangerskap3,6</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker kvinner som donerte sine placentas for denne studere. Vi takker også arbeids- og levering avdeling ved OHSU og mors og Fetal Research Team for å koordinere innsamlingen av placentas. Vi er takknemlige for Eric Wang, Ph.D., og Kelly Kuo, MD for støtte og hjelp med eksperimentelle metoder og optimalisering.
Dette arbeidet ble finansiert av NIH HD076259A (AM) og AHA GRNT29960007 (AM).
Materials
| 10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
| MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
| Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
| Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
| Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
| K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
| Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
| Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
| TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
| Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
| Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
| Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
| Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |
References
- Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).
- van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).
- Yogev, Y., Catalano, P. M. Pregnancy and obesity. Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 36 (2), 285-300 (2009).
- Basu, S., et al. Pregravid obesity associates with increased maternal endotoxemia and metabolic inflammation. Obesity (Silver Spring). 19 (3), 476-482 (2011).
- Muralimanoharan, S., Guo, C., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in miR-210 expression and mitochondrial dysfunction in the placenta with maternal obesity. Int J Obes (Lond). 39 (8), 1274-1281 (2015).
- Myatt, L., Maloyan, A. Obesity and placental function. Semin. Reprod. Med. 34 (1), 42-49 (2016).
- Aune, D., Saugstad, O. D., Henriksen, T., Tonstad, S. Maternal body mass index and the risk of fetal death, stillbirth, and infant death: a systematic review and meta-analysis. JAMA. 311 (15), 1536-1546 (2014).
- Eriksson, J. G., Kajantie, E., Osmond, C., Thornburg, K., Barker, D. J. P. Boys live dangerously in the womb. Am. J. Hum. Biol. 22 (3), 330-335 (2010).
- Kliman, H. J., Knobil, E., Neill, J. D. Trophoblast to human placenta. Enc. Reprod. 4, 834-846 (1999).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
- Bax, C. M., et al. Ultrastructural changes and immunocytochemical analysis of human placental trophoblast during short-term culture. Placenta. 10 (2), 179-194 (1989).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells’ calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
- Muralimanoharan, S., Gao, X., Weintraub, S., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in activation of placental autophagy in obese women with evidence for fetal programming from a placenta-specific mouse model. Autophagy. 12 (5), 752-769 (2016).
- Matsunaga, K., et al. Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 385-396 (2009).
- Zhong, Y., et al. Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 468-476 (2009).
- Yang, C. -. S., et al. Autophagy Protein Rubicon Mediates Phagocytic NADPH Oxidase Activation in Response to Microbial Infection or TLR Stimulation. Cell Host & Microbe. 11 (3), 264-276 (2012).
- Yang, C. -. S., et al. The Autophagy Regulator Rubicon Is a Feedback Inhibitor of CARD9-Mediated Host Innate Immunity. Cell Host & Microbe. 11 (3), 277-289 (2012).
- Zi, Z., et al. Rubicon deficiency enhances cardiac autophagy and protects mice from lipopolysaccharide-induced lethality and reduction in stroke volume. J. Cardiovasc. Pharmacol. 65 (3), 252-261 (2015).
- Mele, J., Muralimanoharan, S., Maloyan, A., Myatt, L. Impaired mitochondrial function in human placenta with increased maternal adiposity. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 307 (5), E419-E425 (2014).
- Mor, G., Cardenas, I., Abrahams, V., Guller, S. Inflammation and pregnancy: the role of the immune system at the implantation site. Ann N Y Acad Sci. 1221 (1), 80-87 (2011).
- Resi, V., et al. Molecular inflammation and adipose tissue matrix remodeling precede physiological adaptations to pregnancy. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 303 (7), E832-E840 (2012).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
- Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10 (5), 461-470 (2009).
- Sagrillo-Fagundes, L., et al. Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption. JoVE. (113), (2016).
- Segovia, S. A., Vickers, M. H., Gray, C., Reynolds, C. M. Maternal obesity, inflammation, and developmental programming. Biomed. Res. Int. , 418975 (2014).
- Komatsu, M., et al. Tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR. Clin. Chem. 47 (7), 1297-1301 (2001).
- Matsunaga, K., Noda, T., Yoshimori, T. Binding Rubicon to cross the Rubicon. Autophagy. 5 (6), 876-877 (2009).
