Presentamos es un protocolo para el muestreo de tejido velloso placentario humano seguido por el aislamiento de citotrofoblastos para el cultivo celular primario. Tratamiento de trofoblastos con TNFα recapitula la inflamación en el ambiente intrauterino obeso y facilita el descubrimiento de dianas moleculares regulados por inflamación en placentas con obesidad materna.
Obesidad materna está asociada con un mayor riesgo de resultados perinatales adversos que son probablemente mediados por la comprometida función placentaria que puede atribuirse, en parte, la desregulación de la autofagia. Cambios aberrantes en la expresión de los reguladores de la autofagia en las placentas de embarazos obesos pueden ser regulados por procesos inflamatorios asociados con la obesidad y embarazo. Se describe aquí es un protocolo para toma de muestras de tejido velloso y aislamiento de citotrofoblastos velloso de la placenta humana de término para el cultivo celular primario. Esto es seguido por un método para simular el ambiente inflamatorio en el ambiente intrauterino obesidad por el tratamiento primarios trofoblastos de embarazos magros con el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), una citoquina proinflamatoria que está elevada en la obesidad y en embarazo. A través de la implementación del protocolo descrito aquí, se encuentra que la exposición a exógena TNFα regula la expresión de Rubicon, un regulador negativo de la autofagia en trofoblastos de la magros embarazos con fetos femeninos. Mientras que una variedad de factores biológicos en el ambiente intrauterino obeso mantienen el potencial de modular las vías críticas en trofoblastos, este sistema ex vivo es especialmente útil para determinar si los patrones de expresión observados en vivo en placentas humanas con obesidad materna son un resultado directo de la señalización de TNFα. En última instancia, este enfoque brinda la oportunidad de analizar las implicaciones reglamentarias y moleculares de inflamación asociados con la obesidad materna en autofagia y otras vías celulares críticos en trofoblastos que tienen el potencial de impacto función placentaria.
La obesidad es un estado inflamatorio caracterizado por inflamación crónica de bajo grada, derivadas del exceso de tejido adiposo y la disponibilidad de nutrientes. En obesidad, citocinas proinflamatorias son elevados en los tejidos metabólicos así como sistémicamente en circulación. Un sólido cuerpo de evidencia ha demostrado que TNFα se eleva significativamente en el ámbito de la obesidad con implicaciones en la resistencia a la insulina y la disfunción metabólica1. Activación de TNFα también contribuye a la patogénesis de la enfermedad en condiciones como el cáncer y autoinmunidad, lo que es una diana terapéutica atractiva2.
Inflamación en la obesidad se ve agravada por el embarazo, también una proinflamatorias del estado3,4. Se ha demostrado previamente que contenido TNFα placentaria aumenta con la adiposidad materna en embarazos con fetos femeninos. Además, el tratamiento TNFα inhibe la respiración mitocondrial en células de trofoblasto femeninas pero no masculinas, lo que sugiere que TNFα está implicado en la regulación del metabolismo placentario en un dimorfismo sexual de la forma5. Obesidad materna está asociada con el aumento de la incidencia de una variedad de complicaciones durante el embarazo, incluyendo a parto muerto, con fetos masculinos, siendo los más susceptibles de3,6,7,8 . Debido a su papel clave en la interfase materno fetal, cambios en la capacidad funcional de la placenta en el ambiente intrauterino obesidad en respuesta a señales inflamatorias pueden desempeñar un papel importante en la mediación de los resultados de embarazos de obesos.
Citotrofoblastos y sincitiotrofoblastos en el tejido velloso de la placenta son críticos para la señalización endocrina y el intercambio de nutrientes y oxígeno entre la madre y el feto en desarrollo9. Alteraciones en la capacidad funcional de citotrofoblastos velloso (en lo sucesivo, trofoblastos) pueden comprometer la salud fetal y el desarrollo. Este protocolo describe un método para el muestreo de tejido velloso de la placenta de término humano por disección a las placas coriónicas y basals junto con un procedimiento optimizado para el aislamiento de trofoblastos para el cultivo celular primario. Este protocolo se deriva de metodologías establecidas que implica la digestión enzimática del tejido velloso para liberar las células de la matriz extracelular, seguido por centrifugación diferencial de densidad para aislar trofoblastos10, 11,12. Este detalles de protocolo un enfoque en que primaria trofoblastos de placentas de embarazos magros son tratados con medios de cultivo suplementados con TNFα para simular uno de los componentes del ambiente inflamatorio asociado con la obesidad materna. Por último, se describe un procedimiento simple para la recolección de lysates de la célula total de trofoblastos tratados con TNFα seguidas de Western blot para detectar cambios en la expresión génica.
Mientras que este modelo no recapitular el entorno obesogénico en el útero en su totalidad, ofrece un sistema controlado que permite analizar la contribución individual de la inflamación mediada por el TNFα ante los trofoblastos obesidad materna. Este modelo brinda la oportunidad de ambos para descubrir o confirmar dianas moleculares directamente reguladas por señalización de TNFα en trofoblastos como permite para probar si observaron cambios en los patrones de expresión génica en vivo en placentas con maternal la obesidad puede ser el resultado de la inflamación mediada por el TNFα.
El enfoque se describe aquí se implementó para probar el efecto de la inflamación mediada por el TNFα en la regulación de la autofagia en trofoblastos humanos. Trofoblastos de obesos embarazos con fetos masculinos exposición interrumpen facturación autophagic o autophagosome maduración13. Una proteína llamada Rubicón (RUN dominio proteína interacción Beclin1 y ricos en cisteína que contiene), que se localiza en los lisosomas y endosomas finales, se ha descrito recientemente como un “freno” en el proceso de autofagia facturación porque funciona como una negativa regulador de autophagosome maduración14,15. De hecho, el Rubicon es un raro ejemplo de una proteína que frena la autofagia, lo que lo convierte en un valioso objetivo terapéutico. Muy poca información está disponible sobre el significado fisiopatológico de Rubicon, excepto por sus papeles en la respuesta inmune innata a microbials16,17 y cardiomiocitos protección18. Utilizando el protocolo descrito aquí, se encuentra que el Rubicon es upregulated en trofoblastos femenino primarios en la respuesta al tratamiento con el aumento de las concentraciones de TNFα hasta 250 pg/mL. La regulación de Rubicon puede desempeñar un papel en cómo hembra fetos precio mejor que los machos en embarazos con obesidad materna. Recapitulando la inflamación asociada con la obesidad materna ex vivo exponiendo trofoblastos humanos a TNFα exógena proporciona una plataforma para estudiar el impacto del obesidad ambiente intrauterino en la regulación de las vías críticas en trofoblastos y por extensión, función placentaria.
La placenta, responsable de regular el crecimiento del feto, exhibe función comprometida en el ambiente obesidad6. A pesar de las altas demandas metabólicas de trofoblastos, placentas con obesidad materna presentan respiración mitocondrial disfuncional6,19. Cambios en el metabolismo placentario pueden contribuir a la mayor incidencia de complicaciones y los resultados fetales adversos observados en embarazos obesos3</s…
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen a las mujeres que donaron sus placentas para este estudio. También agradecemos el trabajo y entrega Departamento OHSU y Maternal y Fetal equipo de investigación de la coordinación de la colección de placentas. Agradecemos a Eric Wang, pH.d. y Kelly Kuo, MD por apoyo y ayuda con métodos experimentales y optimización.
Este trabajo fue financiado por los NIH HD076259A (AM) y AHA GRNT29960007 (AM).
10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
6 well plates | Corning | 353046 | |
Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |