Zika 바이러스 유도 신경 장애 Intracerebral 주입 전략을 사용 하 여 마우스 모델을 수립: 배아, 신생아, 및 성인

요약

여기는 마우스에서 바이러스 유도 microcephaly Zika의 모델을 설정 하는 방법에 설명 합니다. 이 프로토콜에는 Zika 바이러스의 미 발달, 신생아, 그리고 성인 무대 intracerebral 접종에 대 한 메서드가 포함 됩니다.

초록

Zika 바이러스 (ZIKV) 북쪽, 중앙, 그리고 남아메리카에 현재 발병 flavivirus는 이다. 이제는 ZIKV microcephaly 및 추가 뇌 이상이 발생할 수 있습니다 설치 된다. 그러나, 발전 두뇌에 있는 ZIKV의 병 인을 기본 메커니즘 불분명 남아 있습니다. Intracerebral 수술 방법은 자주 주소 질문 정상과 비정상적인 두뇌 개발 및 뇌 기능에 대 한 신경 과학 연구에 사용 됩니다. 이 프로토콜 클래식 수술 기법을 활용 하 고 마우스 신경 시스템에서 하나의 모델 ZIKV 연관 된 인간의 신경 질환을 허용 하는 방법에 설명 합니다. 직접 뇌 접종 바이러스 전송의 정상 모드를 모델링 하지 않습니다, 하는 동안 메서드를 사용 하면 개발 두뇌의 ZIKV 감염 후 결과 관한 대상 질문을 조사 수 있습니다. 이 프로토콜의 ZIKV intraventricular 접종의 미 발달, 신생아, 및 성인 단계를 설명합니다. 일단 마스터,이 방법만 수행 하는 몇 시간을 소요 하는 간단 하 고 재현성 기술 될 수 있다.

서론

Microcephaly 결함이 두뇌 개발 신생아에서 평균 머리 크기 보다 작은 특징에서 유래 하는 조건입니다. Microcephaly 어린이 발달 지연, 발작, 지적 장애, 난청, 시력 문제, 그리고 운동 및 균형, 다른 가운데, 질병의 심각도 따라 문제를 포함할 수 있는 증상의 범위를 전시 하 고 원인^1,2,3. 이 상태는 자연, 유전적, 전염 성 에이전트와 일으키는 microcephaly^{4,,56,,78에 연결 하는 환경 요인에 multifactorial 9}. ZIKV 2015-2016 발발 전에 10000 출생에서 8 어린이 microcephaly¹⁰CDC 따르면 미국에서 진단 했다. 에 2 월 1^일 2016....

프로토콜

모든 동물 프로토콜 따라 대학 남부 캘리포니아와 조지아의 대학의 동물 관리 지침을 사용 합니다. 임신 댐 및 성인을 위한 안락사 방법을 승인 된 프로토콜에 따라 수행 됩니다: 이산화탄소 질 식, 뒤에 안락사를 위해 보조 방법으로 자 궁 경관 탈 구. 신생아 강아지 잘린 여 안락사 된다.

주의: 다음 프로토콜 병원 성 바이러스 처리 작업이 포함 됩니다. 바이러스를 처리 하는 동안 적절 한 예방 조치를 취해야 한다. 모든 프로토콜을 사용 하 여 적절 한 기관 위원회 사전에 의해 승인을 받아야 한다.

1. 배아 Intracerebral 접종 Zika 바이러스의

1. 초과 임신 짝짓기, E0.5로 짝짓기 후 하루의 정오를 고려 하십시오. 하루의 끝에서 마우스를 연결 하 고 시간 짝짓기의 다양성을 줄이기 위해 이른 아침에 플러그를 확인 합니다.
2. 수술 전에 유리 바늘을 준비 합니다. 당겨 바늘의 길이 1/3에서 잘라 다음 50-70 µ m. 체크 바늘 팁 stereoscope 품질 및 파손에 대 한 아래에 기 공 크기가 될 때까지 물 똑으로 micropipette 분쇄기를 사용 하 여 45 ° 각도에서 선명 하 게 합니다.
3. 계속 바이러스 aliquot 얼음....

결과

미 발달 두뇌의 ZIKV 접종에 대 한 우리의 주입 방법의 대표 이미지 intracerebral 주사 (그림 1A)를 묘사 하는 다이어그램에 표시 됩니다 및 자궁내 intraplacental 주사 (그림 1B), 설명 하 고는 방법은 임신 댐과 배아에 볼와 수술 (배아 접종 프로토콜)에 대 한 지향 있어야 합니다. 그림 2A 전시 E18.5 대뇌 피 질에서 ZIKV (MEX1-44) 감염 (flavivirus 그룹 항 원, 녹색에 대 한 항 체와 immunostained). Pax6 (빨간색) 개발 피에 Npc를 라벨. ZIKV는 E14.5 미 발달 머리에 주사 했다. 우리의 성장 곡선 분석 표시 하는 ZIKV 한 조직 샘플⁷, TCID50 분석 결과 사용 하 여 복제 .......

토론

여기서 설명 하는 것은 두뇌 개발에 ZIKV 유도 손해의 조사에 대 한 미 발달, 신생아, 및 성인 단계에는 ZIKV의 intracerebral 접종에 대 한 방법이입니다. 동안 간단, 조사 연구의 품질 및 그 참여의 안전을 보장 하기 위해 취해야 하는 몇 가지 고려 사항이 있다.

DENV는 flavivirus 속에 ZIKV 밀접 하 게 관련 있다. DENV 하지 원인이 인 간에 있는 소아 뇌 장애와 연결 되어있다. DENV2 수 있습니다 성공적으로 감염 하 고 배아 접종 방법을 사용 하 여 개발 두뇌에 복제 (~ 3.4 x 10의 1 µ L⁵ TCID50/mL) (그림 2D). 따라서 감염 되지 않은 Vero 세포 미디어 (모의), 뿐만 아니라 DENV 감염 사용할 수 있습니다 부정적인 제어로 개발 두뇌 병 인 ZIKV 관련 공부 하기 위하여. 그것은 바이러스 누설에 방지 utero에서, .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
플렉시블 드라이브 샤프트 드릴 교수형 모터	라이카	39416001
마우스 스테레오택스	Kopf	04557R
Micro4 Microsyringe 펌프 컨트롤러	WPI	SYS-MICRO4
UMP3 UltraMicroPump	WPI	UMP3
Modulamp
tubing (19-gauge)	Hamilton	90619
융점 모세관	Kimble	34500-99	유리 바늘
Fluoro-Max : 적색 형광 마이크로 스피어	Thermo Scientific	R25	희석 없음; 연습 주사를 위한 사용
10 µ L, 모델 1701 LT SYR	Hamilton	80001	배아 접종 10
µ L, 모델 1701 RN SYR, 소형 탈착식 NDL, 26s ga, 2 in, 포인트 스타일 2	Hamilton	80030	신생아/성인용
4-0 Ethilon 나일론 봉합사	Ethicon-Mineral
Oil	VWR-micropipette
puller	Sutter Instruments	P-1000
Micropipette Grinder	Narishige	EG-44
Fastgreen FCF Dye	Sigma	F7252	주입 0.5% 염료
<강한>항체
플라비바이러스 그룹 항원 항체	Millipore	MAB10216	ms IgG2a 1:400 (그림 2, 그림 3)
Pax6	DBHB	Pax6-s	ms IgG1 1:20

Schott-Luer-lock