감염 성병 제조 및 방지를 위한 Griffithsin 수정 섬유 장비의 특성

Summary

이 원고 조작 하 고 인간 면역 결핍 바이러스 1 형 감염에 대 한 강력한 접착제 및 항 바이러스 활동을 보여 주는 Griffithsin 수정 폴 리 유산 공동 glycolic acid () electrospun 섬유를 특성화 하는 절차를 설명 합니다. 생체 외에서. 합성 하는 데 사용 하는 방법 표면 수정, 결과 형태, 활용, 특성 및 표면 수정 섬유에서 Griffithsin의 탈 착에 설명 되어 있습니다.

Abstract

Electrospun 섬유 (EFs) 널리 다양 한 치료 애플 리 케이 션;에 사용 되었습니다. 그러나, 그들은 단지 최근에 적용 되었을으로 방지 하 고 치료 성적으로 기술 전송 감염 (STIs). 또한, 많은 EF 기술 biofunctionality를 얻으며 표면을 활용 하 여 상대적인 활성 에이전트를 캡슐화에 초점. 여기 조작 및 poly(lactic-co-glycolic) 산 (PLGA) electrospun 섬유, 강력한 항 바이러스 lectin Griffithsin (GRFT)와 표면 수정 하는 방법을 설명 합니다. PLGA는 약물 전달의 뛰어난 화학 및 생체 특성 때문에 널리 사용 된는 FDA 승인 중합체 이다. GRFT 자연, 강력한, 및 안전 lectin 인간 면역 결핍 바이러스 1 (hiv-1) 형을 포함 하는 수많은 바이러스에 대 한 광범위 한 활동을 소유 하는. 결합 될 때, GRFT 수정 섬유 체 외에에이즈-1의 강력한 비활성화를 증명 하고있다. 이 원고에서는 조작 하 고 GRFT 수정 EFs를 특성화 하는 방법을 설명 합니다. 첫째, PLGA 섬유 비 계를 만들 electrospun입니다. 섬유는 이후에 표면 수정 1을 사용 하 여 GRFT-에틸-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) 및 N-hydroxysuccinimide (NHS) 화학. 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 크기와 표면 수정 공식의 형태를 평가 하기 위해 사용 되었다. 또한, gp120 또는 조류 (하)-기반된 ELISA, 활용 된 GRFT GRFT 섬유 표면에서 탈 착의 양을 계량 하 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 섬유를 서로 다른 단백질의 다양 한 표면 수정 조작 하 더 광범위 하 게 적용할 수 있습니다.

Introduction

국 소 전달 플랫폼으로 EFs 사용 하 여 성병을 줄일 가능성이 있다. 현재, 36 백만 이상의 사람들이 HIV에 보고 2015 혼자^1,2의 이상 2 백만 새로운 케이스와 함께 살고 있다. 또한, 포진 심 플렉스 바이러스 2 (HSV-2) 감염의 영향을 수백 전세계 사람들의 수백만 입력 하 고 2-5 배³HIV의 수집을 향상을 보여줘 왔다. 이 관계 HSV-2 감염 및 HIV 취득으로 인해 여러 성병에 대 한 동시 보호를 제공 하는 새로운 활성 에이전트 개발에 상당한 관심이입니다. 또한, 이러한 항 바이러스 대리인의 납품을 개선 하기 위해 새로운 차량의 개발 추가 보호 및 치료 효능을 향상 시키기 위해 잠재력을 제공 합니다. 이 목표를 향해 EFs V-1와 h s V-2 감염의 보급을 줄이기 위해 새로운 배달 플랫폼으로 조사 되어 있다.

지난 2 년 동안 EFs는 약물 전달 및 조직 공학⁴의 분야에서 광범위 하 게 사용 되어 왔습니다. 종종, 생체 고분자는 쉽게 치료 응용 프로그램을 변환할 선택 됩니다. 고분자 EFs를 조작 하 선택 된 폴리머는 유기 용 제 또는 수성 솔루션에 폴리머 hydrophobicity⁵의 정도 따라 녹입니다. 관심의 활성 에이전트 다음 전기 과정 이전 또는 수성 솔루션에 추가 됩니다. 폴리머 솔루션 다음 주사기로 발음 이며 천천히 전류 따라 나옵니다. 이 프로세스는 일반적으로 폴리머 섬유 시트 또는 원통형 macrostructures (그림 1)와 마이크로-나노 규모⁶에서 배열 하는 섬유 직경에에서 발생 합니다. 가장 치료 응용 프로그램에 대 한 활성 에이전트 전기 과정에서 섬유 안에 통합 되 고 확산 및 후속 섬유 저하를 통해 섬유에서 해제 됩니다. 속도 저하 또는 자료의 다른 유형의 폴리머를 사용 하 여 변경 될 수 있습니다 또는 폴리머 혼합⁷을 독특한 화학 및 물리적 특성 부여 하 고 거의 모든의 캡슐화를 추진 하 고 원하는 릴리스 프로필을 설정 하 복합. 따라서, EFs는 작은 분자 약물 및 단백질, 펩 티 드, oligonucleotides, 및 성장 요인^6,,89를 포함 하 여 생물 학적 에이전트의 배달에 도움이 입증 했습니다.

STI 예방 분야에서 EFs 최근 사용 된 통합 하 고 지속 또는 유도할 수 있는-릴리스 항 바이러스 대리인^{10,,1112,13,14의 제공 ,15,,1617,,1819}. 초기 연구 중 하나에서 전화 응답 섬유 에이즈-1¹¹에 대 한 보호의 온-디맨드 방법으로 활성 에이전트 (FRT) 여성 재생산 지역 내 환경 변화에 대응을 출시 개발 되었다. 이후, 다른 연구 조사 폴리머 혼합 폴 리 에틸렌 산화물 (PEO)와 폴 리-L-젖 산 (PLLA), 에이즈-1 예방 및 피임 생체 외 ^{에 대 한 항 바이러스 및 피임 제의 가변 평가의 구성 12}. 추가 연구는 다음을 제공 하는 EFs의 타당성 증명: 작은 분자 antivirals¹⁴, 강한 릴리스 및 유연한 기계적 특성²⁰, 3 차원 배달 아키텍처^{21 연장} , 정자 침투¹², 그리고 다른 배달 기술¹³와 병합 하는 능력의 저해. 마지막으로, 이전 작업 일반적인 co-infective 바이러스, HSV-2와 에이즈-1¹⁴에 대 한 항 바이러스 제의 지속적인 배달에 대 한 고분자 섬유를 평가 했다. 이 연구에서는 폴리머 섬유 1 달까지 동안 그들의 구조를 유지 하 고 바이러스 항목에 대 한 물리적 방 벽을 제공 하 여 항 바이러스 배달 보완 활동을 제공. 이러한 결과에서 둘 다 물리적 및 화학적 방해 바이러스 감염에 EFs를 사용할 수 있습니다 관찰 되었다.

가변 자료 속성을 고분자 EFs microbicide 배달에 대 한 매력적인 전달 플랫폼, EFs 표면 수정 건설 기계⁷을 다른 응용 프로그램에서 개발 되었습니다. 종종 역할 건설 기계 세포 재생²², 개선 하 고 조직 공학^23,24에 그들의 유틸리티를 강화 하는 세포 외 기질 (ECM)의 형태를 모방 하기 위해 eFs 사용 되었습니다. 섬유 고분자 폴 리-ε-caprolactone (PCL) 등으로 구성 되었으며 PLLA 성장 인자와 단백질 표면 수정 후 전기를 얻으며 ECM 같은 속성 증가 세포 접착 및 확산²⁵ 를 포함 하 여 ^{, 26}. 항균 성 표면 수정 EFs 특정 병원 성 박테리아^27,28의 성장을 방지 하기 위해 평가 또한. 이 다양성 및 생물 학적 효과 유도 하는 능력, EF 기술 다양 한 기계 멀티 기능을 제공 하는 분야에서 확장 하 고 있습니다. 그러나, 그들의 유틸리티 애플 리 케이 션의 다양성에도 불구 하 고 표면 수정 섬유 최근에 microbicide 필드²⁹탐험 되었습니다 있다.

방지 하 고 성병 치료 배달 신기술 개발 병행, 새로운 생물학적 치료제 개발 되었습니다. 가장 유망한 microbicide 후보자 중 하나 접착제 항 바이러스 lectin, GRFT³⁰입니다. 원래 빨강 조류의 종에서 파생 된, GRFT는 설명 했다 HIV, HSV-2, SARS의 강력한 억제제로 활동 뿐만 아니라 C 형 간염 바이러스^{31,32,,3334, 35 , 36}. 사실, 생물학 기반의 억제제 중 GRFT는 가장 강력한 반대로 HIV 활동 하면서 안정성과 질에서 문화 미디어 존재 활동 연락처³⁰, 시 거의 즉시 V-1를 비활성화 최대 10 일³⁷미생물. 더 최근에, 0.1 %GRFT 젤 자 HSV-2 도전, 그것은 HSV-2와 에이즈-1³² 에 대 한 보호의 첫 번째 줄에 대 한 유망한 후보 만들기에 대 한 마우스를 보호 하기 위해 표시 했다^{, 38}. 에이즈에 대 한 GRFT 물리적 항목^{38,,3940,41 방지 하기 위해 바이러스 성 봉투 표면에 gp120 또는 터미널만 노 오 스 N 연결 glycan 잔류물을 바인딩 하 여 감염을 억제 하는 특히, ,42}. 이 억제는 매우 강력한 IC₅₀s 3 ng/mL⁴³접근. HIV 감염을 억제 하는 것 이외에 연구는 또한 보여주었다 GRFT 바이러스³²의 세포-세포 확산을 억제 하 여 감염 HSV-2에 대 한 보호. 모든 경우에, GRFT 변성에 높은 저항을 시연, 바이러스 성 입자에 접착제를 되도록 표시 되었습니다. 마지막으로, GRFT 만들고 그것은 실현 가능성이 EFs와 함께 공동 관리에 도움이 테 (TFV) 및⁴⁴의 다른 antivirals 조합으로 시너지 활동을 시연 하고있다. GRFT의 강력한 속성은 우수한 생물학 기반의 항 바이러스 후보자, 있는 배달 EF 기술로 향상 될 수 있도록 합니다.

GRFT의 접착제 및 타고 난 항 바이러스 속성의이 지식을 활용 하 여, 고분자 섬유 비 계 설계 되었습니다, 이러한 속성을 제공 하는 바이러스 항목 저해²⁹의 첫 번째 계층을 통합 하. Cervicovaginal 점액 mucoadhesive mucin 상호 작용을 통해 주로 바이러스 전송 방해 하는 방법에 영감을 찾기, 우리 가정 했다 그를 발판으로 EFs를 사용 하 여 covalently GRFT의 높은 밀도와 표면 수정 GRFT 표면에 활용 된 것 수 고 entrypoint^45,,4647에서 바이러스를 비활성화. 여기 EFs는 플랫폼을 제공 하는 단백질 기반, 바이러스 성 접착제 비활성화 장벽 고정 발판으로 개발 되었다. 우리를 만드는 새로운 바이러스 “함정.” 생체, 대, 고 내구성 폴리머 플랫폼 GRFT의 적 정량 항 바이러스 특성을 결합 하고자

이러한 목표를 달성 하기 위해 PLGA의 구성 하는 섬유 electrospun, 그리고 EDC-보 건국 화학 GRFT와 EF 표면 그 후 수정 하는 데 사용 되었다. PLGA 전기⁴⁸, 생체 적합성 및 비용 효율성에에서 그것의 광범위 한 사용 모델 폴리머 역임 했습니다. 또한, 표면 개 질 EFs의 큰 표면 영역을 이용 하 고 캡슐화 섬유 유틸리티⁴⁹를 극대화 하기 위해 결합 될 수 있는 유용한 대안을 제공 합니다. 전통적인 캡슐화 방법 어디 GRFT의 일부만 사용할 수 (그리고는 FRT만 뚜렷이 제시), 달리 표면 수정 수 있습니다 가능 치료의 전체 기간 동안 최대 bioactivity를 유지 하는 GRFT 또한, 전통적인 전기 방법으로 단백질 같은 친수성 화합물의 낮은 캡슐화 효율성 및 단백질 활동⁵⁰의 손실 될 수 있습니다. 따라서, GRFT 표면 수정 섬유 STI 감염에 대 한 보호 기능을 향상 하거나 전기와 함께 사용할 수 있는 유망한 대체 배달 방법을 제공할 수 있습니다.

Protocol

1. 준비 및 제조 Electrospun 섬유 발판의 주의: 화학 증기 두건 .에 용 매 또는 폴리머 솔루션으로 모든 작업을 수행 해야 프로토콜을 시작 하기 전에 각 시 약의 물질 안전 데이터 시트를 참조. Electrospin 3 mL 15 %w / w PLGA 폴리머 솔루션에 무게의 50: 50 폴 리 (유산 공동 glycolic 산) 720 mg (PLGA; 0.55 0.75 dL/g, 31-57 kDa) 10 mL 섬광 유리병에. 솔루션의 볼륨은 현재 연구에 사용 되…

Representative Results

섬유 형태 바이러스에 대 한 보호를 제공 하는 표면 수정 EFs의 기능에 상당한 효과가 있다. 전기는 편리 하 고 간단한 절차, 최적화 되지 않은 폴리머 제형 불규칙 한 섬유 형태 (그림 5B-C) 발생할 수 있습니다. 파란색 또는 비정 질 매트 같은 형태학의 대형 귀착되는 전기 조건에서 변경 종종 용 폴리머 호환성, 낮은 폴리머 점도, 흐름 속?…

Discussion

그들의 다공성 구조와 큰 표면 영역, EFs 헬스케어, 치료 배달 차량으로 봉사를 포함 하는 중 하나는 다양 한 응용 프로그램을 발견 했다. 약물 및 다른 활성 에이전트 통합할 수 있습니다 EFs에서 가변 배달 동안 생물 의약품 및 화학 ligands 셀-특정 대상⁵² 또는 바이오 센 싱⁵³섬유 표면에 활용 될 수 있습니다. 여기 GRFT의 제조 표면-수정 PLGA EFs, HIV 감염을 방지 하기…

Materials

Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50	Lactel	B6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)	Thermo Scientific	147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2	Brico Medical Supplies	BN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tip	VWR	309657
Parafilm (plastic film)	Sigma Aldrich	P7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer)	Sigma Aldrich	M3671
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S7653
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9333
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S7907
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P0662
Hydroxysuccinimide (NHS)	Thermo Scientific	24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC)	Thermo Scientific	22980
2-Mercaptoethanol	Fisher	BP176
Griffithsin (GRFT)	Kentucky Bioprocessing	NA	custom made, no product number
Dimethyl Sulfoxide	Milipore	317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20)	Sigma Aldrich	P9416
Tris EDTA Buffer	Sigma Aldrich	93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates	Thermo Scientific	3355
Influenza Hemagglutinin (HA)	Kentucky Bioprocessing	NA	custom made, no product number
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody)	Kentucky Bioprocessing	NA	custom made, no product number
Donkey anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody)	Santa Cruz	2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate	KPL	52-00-00