Субцеллюлярные фракционирование Эрк активации на митохондриальной производные пептид лечение
Summary
Этот протокол описывает стимулируют клетки с митохондриальных производные пептидов и оценить сигнальный Каскад и локализации Фосфоропротеиды.
Abstract
Пептиды митохондриальной производных (MDPs) являются новый класс пептидов, которые кодируются в небольших открытых чтения фреймов внутри других известных генов митохондриального генома. MDPs имеют широкий спектр биологических эффектов, таких как защита от апоптоза нейронов, улучшение метаболических маркеры и защите клеток от химиотерапии. Humanin был первым MDP быть открынным и является наиболее изученным пептид среди MDP семьи. Тщательно характеризовались мембранных рецепторов и ниже по течению сигнальных путей humanin. Совсем недавно были обнаружены дополнительные MDPs например MOTS-c и SHLP1-6 и сигнальных механизмов еще должны быть освещены. Здесь мы описываем клетки культуры на основе метода определения функции этих пептидов. В частности методы фракционировки клетки в сочетании с Западный blotting позволяют для количественного определения активации и транслокации важных сигнальной молекулы. Хотя существуют другие методы фракционировки клетки, описанные здесь является простой и простой метод. Эти методы могут использоваться для дальнейшего выяснения механизма действия этих пептидов и других терапевтических агентов.
Introduction
Новые исследования показывают, митохондриальных производные пептидов (MDPs) играют важную роль в cytoprotection и метаболизма1,2,3. Понимание пути трансдукции сигнала в присутствии MDPs дает нам представление о механизм, по которому MDPs модулировать различные функции. Первый выявленных MDP, humanin, было показано, что увеличение внеклеточного сигнала регулируется киназы 1/2 (ERK1/2) фосфорилирование через свой рецептор привязки4,5. Однако до сих пор underexplored течению эффект активации ERK1/2.
ERK1/2 каскада служит важным посредником в различных клеточных процессах, включая распространение, миграции клеток, клеточный метаболизм, выживания и апоптоз6,,78. Для всех этих различных клеточных процессов, деятельности и внутриклеточных локализации ERK1/2 жестко регулируются фосфатаз и эшафот белки9,10. В дополнение к столб-поступательные изменения динамический челночные ERK1/2 также регулирует его сигнальной функции, деятельность и специфика11,12. ERK1/2 локализуется преимущественно в цитозоль13. Набор крепления и леска белков помогают сохранить ERK1/2 цитоскелетных элементов, на поверхности органеллы, или рассеянным в цитоплазме13. После стимуляции ERK1/2 является фосфорилированных и становится в отрыве от его закрепления белков, позволяя транслокации ERK1/2 для других внутриклеточных отсеков, включая ядро, митохондрии, Гольджи и лизосом14, 15 , 16.
Хотя humanin известен для того чтобы активировать сигнальный путь ERK1/2, в всего lysates клетки только наблюдается активации ERK1/2. Как описано ранее, поскольку локализация внутриклеточных ERK1/2 играет решающую роль в ее течению эффект, анализ субцеллюлярные локализации и общий уровень фосфорилированных ERK1/2 необходимо обеспечить полное понимание humanin индуцированной активации ERK1/2 и активации течению целей.
Чтобы понять цель органеллы активированного ERK1/2, была выполнена субцеллюлярные фракционирования, следуют Западный blotting для фосфорилированных ERK1/2. Этот метод может быть легко реализован как он использует стандартные лабораторного оборудования и реагентов. Высокой чистоты, позволяя результаты прямолинейно трактовать субцеллюлярные изолированных отсеков. Иммуноокрашивания ERK1/2 может дать аналогичные результаты. Однако некоторые субцеллюлярные отсеков относительно трудно визуализировать и требуют специальных методов фиксации и permeabilization. ERK1/2 уровни различаются в отсеках, субклеточном, и этот вариант может вызвать ложные положительные, так и отрицательные сигналы при взгляде на весь lysates клетки. Таким образом immunoblot с помощью изолированных отсеков субцеллюлярные дает нам лучшее понимание локализации ERK1/2.
Универсальность метода позволяет модификации протокола для расследования последствий других стимуляторов, включая другие MDPs или транслокации других сигнальных молекул, таких как STAT3. Недавно обнаружил небольшой humanin подобных пептидов (SHLPs) кодируются с 16S рРНК региона, где humanin кодируется, и они имеют аналогичные, но различные свойства, по сравнению с HN17. К примеру SHLP2 и SHLP3 активировать ERK1/2 после того, как 8 h хотя humanin активирует ERK1/2 в течение 5 минут изучения субцеллюлярные локализации ERK1/2 в ответ на различные пептиды даст нам лучше понять биологии этих пептидов. Новые данные показали, что локализация внутриклеточных сигнальных молекул играет решающую роль в их нижнем эффекты. К примеру STAT3 традиционно известен в основном локализовано в цитозоле клеток отдых, а затем он translocates в ядро для того чтобы активировать экспрессии генов в ответ цитокинов18. STAT3 также translocates митохондрий и регулирует TCA цикла и производства АТФ19. Что касается регулирования autophagy различных внутриклеточных локализации STAT3 модулирует autophagy в различных способов20. Например ядерные STAT3 транскрипционно регулирует autophagy связанных генов и действует как модулятор autophagy. Цитоплазматическая STAT3 конститутивно подавляет autophagy, взаимодействуя с autophagy сигнальных молекул. Митохондриальной STAT3 препятствует и предотвращает mitophagy, подавляя Оксидативный стресс индуцированной autophagy. Таким образом этот метод изоляции субцеллюлярные отсек имеет решающее значение для понимания роли других сигнальных молекул, а также ERK1/2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы показали, что humanin пептид опосредованной активации ERK1/2 происходит в двух различных типов клеток, и внутриклеточных локализации активированного ERK1/2 может быть различным в зависимости от условий (например, дозой пептида, момент времени, и клетки тип). Было доказано, что humanin ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана докторантура стипендий Эллисон/Афар в старения программы исследований для SJK, и премии Фонда Гленн и низ предоставляет ПК (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). Все авторы появляются в фильме.
Materials
| p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell signaling | 9102 | Dilution 1:1,000 |
| phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204) | Cell signaling | 4370 | Dilution 1:1,000 |
| Lamin B1 | Cell signaling | 12586 | Nuclear Marker, Dilution 1:1,000 |
| GAPDH | Cell signaling | 5174 | Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000 |
| Tom20 | Santa cruz | SC-17764 | Mitochondria marker, Dilution 1:2,000 |
| anti-Rabbit-HRP conjugated | Cell signaling | 7074 | Dilution 1:30,000 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 89900 | |
| 100 mm Culture Dish | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12556002 | |
| HNG peptide | Genescript | ||
| 25mm sylinge filter | ThermoFisher SCIENTIFIC | 09-719A | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP151-100 | |
| EDTA | Sigma | 3609 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Tris-base | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP152-1 | |
| HCL | Sigma | H1758 | |
| PBS | Lonza | 17-512F | |
| Cell Scraper | FALCON | 353085 | |
| Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 78440 | |
| Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles | Thomas Scientific | 3432S90 | |
| Tween-20 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP337-500 | |
| BSA | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP1600-100 | |
| 8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BIO RAD | 4561104 | |
| Mini Trans-Blot Module | BIO RAD | 1658030 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BIO RAD | 1704150 | |
| Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit | BIO RAD | 1704272 | |
| Clarity Western ECL Blotting Substrates | BIO RAD | 1705060 | |
| Restore Western blot stripping buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 21059 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11965-092 | |
| Sonicator, Medel: FB120 | ThermoFisher SCIENTIFIC | 695320-07-12 |
References
- Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance. J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).
- Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action. PloS one. 4 (7), 6334 (2009).
- Lee, C., Yen, K., Cohen, P. Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides. Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).
- Kim, S. J., Guerrero, N., et al. The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus. Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).
- Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
- Zhang, W., Liu, H. T. MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells. Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).
- Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. MAP kinases and cell migration. J. Cell Sci. 117, 4619-4628 (2004).
- Cagnol, S., Chambard, J. -. C. ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death–apoptosis, autophagy and senescence. FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).
- Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
- Morrison, D. K., Davis, R. J. Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).
- Wainstein, E., Seger, R. The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles. Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).
- Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. The subcellular localization of MEK and ERK–a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus. Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).
- Kolch, W. Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).
- Horbinski, C., Chu, C. T. Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death. Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).
- Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization. Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).
- Zhu, J. -. H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases. Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).
- Cobb, L. J., Lee, C., et al. Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers. Aging. 8 (4), 796-809 (2016).
- Ihle, J. N. The Stat family in cytokine signaling. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).
- Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism. Sci. Rep. 6 (1), 39517 (2016).
- You, L., Wang, Z., et al. The role of STAT3 in autophagy. Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).
- Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer’s disease-relevant insults. The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).
- Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
- Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).
