Isolering af intakt, hele musen mælkekirtlerne for analyse af ekstracellulære Matrix udtryk og morfologi, kirtel
Summary
Vi præsenterer her, en protokol til isolering af hele, intakt mus mælkekirtlerne for at undersøge ekstracellulære matrix (ECM) udtryk og duktalt morfologi. Musen #4 abdominal kirtler blev udvundet fra 8-10 uge gammel kvinde har født mus, fast i neutral bufferet formalin, snit og farves ved hjælp af Immunhistokemi for ECM proteiner.
Abstract
Målet med denne procedure var at høste #4 abdominal mælkekirtler fra har født hunmus for at vurdere ECM udtryk og duktalt arkitektur. Her, blev en lille lomme under huden oprettet ved hjælp af Mayo saks, giver mulighed for adskillelse af kirtler i det subkutane væv fra den underliggende bughindebetændelse. Visualisering af kirtler blev hjulpet på vej af brugen af 3,5 x-R kirurgisk mikro loupes. Pelt blev omvendt og besejrede tilbage giver identifikation af de intakte brystkirtler fedtpuder. Hver af de #4 abdominal kirtler var ligefremt dissekeret af glidende skalpel klinge lateralt mellem det subkutane lag og kirtler. Straks efter høst, kirtler var placeret i 10% neutrale bufferet formalin til efterfølgende væv forarbejdning. Excision af hele kirtlen er fordelagtig, fordi det primært eliminerer risikoen for at udelukke vigtige væv-wide interaktioner mellem duktalt epitelceller og andre microenvironmental cellular populationer, der kan blive savnet i en delvis biopsi. En ulempe ved metoden er brugen af seriel afsnit fra faste væv, som begrænser analyser af duktalt morfogenese og protein udtryk til diskrete placeringer i kirtlen. Ændringer i duktalt arkitektur og protein udtryk i 3 dimensioner (3D) er som sådan ikke let opnåelige. Samlet, teknikken er gældende for undersøgelser som kræver helt intakt murine mælkekirtlerne for downstream undersøgelser såsom udviklingsmæssige duktalt morfogenese eller bryst kræft.
Introduction
Brystkræft er karakteriseret ved en betydelig grad af væv fibrose1,2,3,4. Omtales som ECM, denne ikke-cellulære enhed findes i varierende grader i alle væv og består primært af en kompleks meshwork af fibrillar og ikke-fibrillar collagens, elastin, og glykoproteiner ud over forskellige signaling molekyler, der er afsondret i denne matrix. Homeostatiske betingelser styres deposition og nedbrydning af ECM stramt. 5 under bryst tumordannelse, balance af ECM deposition og nedbrydning er forstyrret. Som sådan, er brysttumorer blevet rapporteret at udtrykke rigelige ECM proteiner som collagens, fibronektin og tenascin-C blandt andre. 6 den unormale udtryk for disse proteiner ud over øget mønstre af matrix crosslinking har dokumenteret for at fremme bryst tumor progression, metastaser og terapi modstand1,3, 4,7,8,9.
For at vurdere ECM sammensætning og duktalt morfologi, blev isolation af intakt mælkekirtlerne udført. Her, vi brugte har født hunmus mangelfuld til caveolin-1, en integreret membran protein, som har været forbundet med en aggressiv bryst tumor signatur10,11,12, og kontrollere kvinde har født B6 mus. Histologiske forarbejdning og farvning af disse væv tilladt identifikation af flere ECM proteiner sammen med karakterisering af duktalt morfologi.
Samlet set giver isolering af hele, intakt mælkekirtlerne forskere mulighed for at undersøge vævet hele morfologiske eller cellulære forandringer i svar på eksogene og endogene faktorer. Ulemper ved teknikken, der er knyttet til analyser af 2 dimension (2D) væv sektioner i stedet for en 3D-perspektiv, hvilket ville give et mere komplet billede af den komplekse morfologi af duktalt træet. Betragtning af kompleksiteten af celle-celle og celle-ECM vekselvirkninger, der finder sted i mælkekirtlen, er isolering af hele, intakt kirtler fordelagtige for effektivt analysere duktalt morfologi og protein udtryk i forskellige regioner af den murine brystkirtler kirtel.
Protocol
Representative Results
Discussion
I papiret, har vi beskrevet en teknik til at isolere intakt mus mælkekirtlerne downstream histologiske analyser af ECM udtryk og duktalt morfologi. Med hensyn til analyser af duktalt morfologi, giver denne metode mulighed for hurtig undersøgelse af duktalt arkitektur baseret ud af farvede histologiske sektioner. Andre metoder af duktalt analyser stole på injektioner af farvestoffer til aktiverer visualisering af duktalt træet, metoder, som kan være teknisk udfordrende og tidskrævende.
I …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende April Wiles og Dr. Roger Broderson for hjælp til dyr obduktion og kirtel isolation, henholdsvis. Finansiering af dette arbejde blev støttet af Philadelphia College af osteopatisk medicin centre for kroniske lidelser af aldring.
Materials
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
References
- Gao-Feng Xiong, R. X. Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression. J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), 38 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).
- Ioachim, E., et al. Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression. Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).
- Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Wang, J. P., Hielscher, A. Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting. J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).
- Qian, N., et al. Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients. Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).
- Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts. J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).
- Witkiewicz, A. K., et al. An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers. Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (4), 533-557 (2012).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr Protoc Neurosci. , (2009).
- Cannata, D., et al. Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation. Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).
- Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands. PLoS One. 12 (2), 0172067 (2017).
- Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation. Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), (2013).
