Isolering av intakt, hele musen brystkjertlene for analyse av ekstracellulær Matrix uttrykk og kjertel morfologi
Summary
Her presenterer vi en protokoll for isolering av hele, intakt musen brystkjertlene undersøke ekstracellulær matrix (EFM) uttrykk og ductal morfologi. Musen #4 abdominal kjertler ble Hentet fra 8-10 uke gamle kvinnelige nulliparous mus, fast i nøytral bufrede formalin, delt og farget med immunohistochemistry for ECM proteiner.
Abstract
Målet med denne prosedyren var å høste #4 abdominal brystkjertlene fra kvinnelige nulliparous mus for å vurdere ECM uttrykk og ductal arkitektur. Her ble en liten lomme under huden opprettet med Mayo saks, slik at separasjon av kjertler i subkutant vev fra underliggende peritoneum. Visualisering av kjertler hjelp ved bruk av 3,5 x-R kirurgisk mikro forstørrelsesglass. Pelt var invertert og låste tilbake tillater identifikasjon av intakt mammary fett pads. Hver av #4 abdominal kjertler var rett ut dissekert etter glidende skalpell bladet lateralt mellom det subcutaneous lag og kjertler. Umiddelbart etter innhøsting, kjertler ble plassert i 10% nøytral bufrede formalin for påfølgende vev behandling. Eksisjon av hele kjertel er en fordel fordi det primært eliminerer risikoen for unntatt viktige vev bred samhandling mellom ductal epitelceller og andre microenvironmental mobilnettet populasjoner som kunne bli savnet i en delvis biopsi. Ettall ulempen av metodikken er bruk av føljetong inndelinger fra fast vev som begrenser analyser av ductal morphogenesis og protein uttrykk til atskilte steder innen kjertel. Som sådan, endringer i ductal arkitektur og protein uttrykk i 3 dimensjoner (3D) er ikke lett oppnåelig. Samlet er teknikken gjelder for studier som krever helt intakt murine brystkjertlene for nedstrøms undersøkelser som utviklingsmessige ductal morphogenesis eller bryst kreft.
Introduction
Brystkreft er preget av en betydelig grad av vev fibrose1,2,3,4. Kalles ECM, denne ikke-mobil enhet finnes i varierende grad i alle vev og består hovedsakelig av en kompleks meshwork av fibrillar og ikke-fibrillar collagens og elastin glykoproteiner i tillegg til ulike signalnettverk molekyler som er sequestered i denne matrisen. Under homøostatisk forhold, er avsettelse og nedbrytning av ECM strengt kontrollert. 5 under brystet tumorigenesis, balansen av ECM avsettelse og fornedrelse blir forstyrret. Som sådan, har bryst tumorer blitt rapportert å uttrykke rikelig ECM proteiner som collagens, fibronectin og tenascin-C blant andre. 6 unormal uttrykket av disse proteinene i tillegg til økt mønstre av matrix crosslinking er dokumentert for å fremme bryst svulst progresjon og metastasering terapi motstand1,3, 4,7,8,9.
For å vurdere ECM sammensetning og ductal morfologi, ble isolering av intakt brystkjertlene utført. Her vi brukte kvinnelige nulliparous mus mangelfull for caveolin-1, en integrert membran protein som har vært knyttet til en aggressiv brystet tumor signatur10,11,12, og kontrollere kvinnelige nulliparous B6 mus. Histologiske behandling og flekker av disse vev tillatt identifikasjon av flere ECM proteiner sammen med karakterisering av ductal morfologi.
Samlet gir isolering av hele, intakt brystkjertlene forskere mulighet til å undersøke vev hele morfologiske eller cellular omveltningene svar eksogene eller endogene faktorer. Ulemper av teknikken er forbundet med analyser av 2 dimensjon (2D) vev seksjoner i motsetning til et 3D-perspektiv, som ville gi et mer komplett bilde av kompleks morfologi av ductal treet. Gitt kompleksiteten i celle-celle og celle-ECM interaksjoner som finner sted i melkekjertlene, er isolering av hele, intakt kjertler fordelaktig for effektivt analysere ductal morfologi og protein uttrykk i ulike regioner for Trouble mammary kjertel.
Protocol
Representative Results
Discussion
I papiret, har vi beskrevet en teknikk for å isolere intakt musen brystkjertlene for nedstrøms histologiske analyser av ECM uttrykk og ductal morfologi. Med hensyn til analyser av ductal morfologi kan denne metodikken rask etterforskning av ductal arkitektur basert på farget histologiske deler. Andre metoder for ductal analyser er avhengige av injeksjoner av fargestoffer aktivere visualisering av ductal treet, metoder som kan være teknisk utfordrende og tidkrevende.
I brystkreft, har ECM b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å erkjenne April Wiles og Dr. Roger Broderson for hjelp med dyr obduksjon og kjertel isolasjon, henholdsvis. Finansiering for dette arbeidet ble støttet av Philadelphia College av osteopatisk medisin Centers for kroniske sykdommer av aldring.
Materials
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
References
- Gao-Feng Xiong, R. X. Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression. J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), 38 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).
- Ioachim, E., et al. Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression. Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).
- Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Wang, J. P., Hielscher, A. Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting. J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).
- Qian, N., et al. Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients. Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).
- Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts. J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).
- Witkiewicz, A. K., et al. An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers. Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (4), 533-557 (2012).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr Protoc Neurosci. , (2009).
- Cannata, D., et al. Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation. Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).
- Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands. PLoS One. 12 (2), 0172067 (2017).
- Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation. Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), (2013).
