有丝分裂细胞同步与高分辨共聚焦显微镜联合应用研究细胞周期蛋白在有丝分裂过程中的作用
Summary
我们提出一个协议的双胸苷同步 HeLa 细胞后, 分析使用高分辨率共聚焦显微镜。这种方法是获得大量的细胞, 同步进行从 S 期到有丝分裂的关键, 使研究的有丝分裂作用的功能蛋白, 也具有相间的作用。
Abstract
研究细胞周期的各种调控事件, 以相依赖的方式提供了一个明确的理解细胞生长和分裂。在细胞周期的特定阶段, 细胞数量的同步被发现在这种实验中非常有用。与毒性相对较小的化学物质进行治疗时, 细胞的同步化可以在药物抑制剂的使用上获得好处, 用于研究相应的细胞周期事件, 并获取特定的有丝分裂阶段的丰富度。在这里, 我们描述了在细胞周期的不同阶段同步人类细胞的协议, 包括 S 相和 M 相的双胸苷块和释放程序, 以研究有丝分裂蛋白在染色体排列中的功能和隔离。本协议对于研究具有已建立的相间功能的多功能蛋白的有丝分裂作用非常有用。在我们的例子中, Cdt1 的有丝分裂作用, 一个关键的蛋白质复制原产地许可在 G1 阶段, 可以有效地研究, 只有当 G2/M-specific Cdt1 可以耗尽。我们用双胸苷同步描述了 G2/M-specific Cdt1 损耗的详细协议。我们还解释了细胞固定的协议, 和活细胞成像使用高分辨率共聚焦显微镜后, 胸苷释放。该方法也有助于分析有丝分裂蛋白在生理和扰动条件下的功能, 如 Hec1, Ndc80 复合物的一个组成部分, 因为它使一个获得大样本大小的有丝分裂细胞的固定和活细胞分析, 我们在这里展示。
Introduction
在细胞周期中, 细胞经历了一系列高度调控和世俗控制的事件, 以精确复制他们的基因组和增殖。在哺乳动物中, 细胞周期由相间和 M 相组成。在相间, 由三个阶段-G1, S 和 G2, 细胞复制它的基因组并且经历成长是必要的为正常细胞周期进展1,2。在 M 阶段, 由有丝分裂 (前期, 中期, 中期, 后期, 和末期) 和胞, 父母细胞产生两个基因上相同的子细胞。在有丝分裂中, 姊妹染色的复制基因组是凝聚 (前期) 和捕获在他们的 kinetochores 通过微管组装的有丝分裂纺锤 (中期), 驱动他们的对准在中期板块 (中期), 其次是他们的当姐妹染色被分裂对和被运输对相反纺锤杆 (后期) 时, 相等的离析。两个子细胞的物理分离由肌动蛋白为基础的收缩环 (末期和胞) 的活动。粒是一种专门的蛋白质结构, 在染色的丝区域装配, 作为主轴微管的附着点。它的主要功能是驱动染色体捕获, 对齐, 并帮助纠正不正确的主轴微管附着, 同时调解主轴组件检查点, 以维护染色体分离的保真度3,4。
细胞同步技术是了解细胞周期进展过程中的分子和结构事件的理想工具。这一方法已被用来丰富细胞群体在特定阶段的各种类型的分析, 包括基因表达谱, 细胞生化过程分析, 和检测蛋白质的亚单位定位。同步哺乳动物细胞不仅可以用于单个基因产品的研究, 也可用于涉及整个基因组分析的方法, 包括基因表达的微阵列分析5, miRNA 表达式模式6,平移调节7, 蛋白质组蛋白分析的修改8。同步也可以用来研究基因表达或蛋白质敲掉或敲出, 或化学物质对细胞周期进展的影响。
细胞可以在细胞周期的不同阶段同步。物理和化学方法都被广泛用于细胞同步。细胞同步的最重要的标准是同步应该是 noncytotoxic 和可逆的。由于药物对细胞同步的潜在不良影响, 化学依赖性方法对研究关键细胞周期事件是有利的。例如, 羟基、amphidicolin、含羞草和洛伐他汀可用于 G1/S 阶段的细胞同步, 但由于它们对它们抑制的生物化学通路的影响, 它们激活了细胞周期检查点机制, 并杀死了一个重要单元格的分数9,10。另一方面, 通过添加胸苷对生长介质的反馈抑制 DNA 复制, 称为 “胸苷阻滞”, 可以在某些点11,12,13中逮捕细胞周期。在 G2/M 阶段也可以通过处理 nocodazole 和 RO-3306914来同步单元格。Nocodazole, 防止微管组装, 具有较高的细胞毒性。此外, nocodazole 细胞可以通过有丝分裂的滑移回到相早熟。双胸苷阻滞细胞在 G1/S 阶段和释放后的块, 细胞被发现进行同步通过 G2 和有丝分裂。在高分辨率的共聚焦显微镜下, 通过细胞固定或活体成像, 可以观察胸苷块释放的细胞周期的正常进展。当细胞进入并通过双胸苷块释放后有丝分裂时, 可以特别研究有丝分裂蛋白的摄动效应。Cdt1 是一种多功能的蛋白质, 在 G1 阶段参与 DNA 复制起源许可, 并且在有丝分裂过程中也需要粒微管附着体 (15。为了研究 Cdt1 在有丝分裂过程中的作用, 我们需要采取一种方法, 在 G1 阶段避免其损耗对复制许可的影响, 同时在 G2/M 阶段只会影响其损耗。在这里, 我们提出了详细的协议的基础上的双胸苷块, 以研究的有丝分裂作用的蛋白质执行多个功能在不同阶段的细胞周期的固定和活细胞成像。
Protocol
Representative Results
Discussion
双胸苷同步的最关键的优点是它在短时间内提供了一个增加的有丝分裂细胞的样本大小, 其中许多细胞进入有丝分裂一致, 从而也使分析染色体对齐, 两极纺锤体形成, 染色体分离, 效率更高。
许多调控蛋白复合物和信号通路致力于确保正常进展通过有丝分裂和解除管制这一过程可能导致肿瘤。动态细胞成像的 HeLa 细胞稳定表达 mCherry-H2B 和 GFP-蛋白和释放从双胸苷块显示, 大多?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢日本东北大学的 Dr. 三, 他们分享了稳定表达 mCherry 组蛋白 H2B 和 GFP-α-蛋白的 HeLa 细胞。这项工作得到了一笔对 DV (R00CA178188) 和西北大学启动资金的支持。
Materials
| DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 degree C |
| DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 | Store at 4 degree C |
| Leibovitz’s (1X) L-15 medium | Life Technologies | 21083-027 | Store at 4 degree C |
| Serum reduced medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 319-85-070 | Store at 4 degree C |
| Penicillin and streptomycin | Life Technologies | 15070-063 (Pen Strep) | 1:1000 dilution |
| Dharmafect2 | GE Dharmacon | T-2002-02 | Store at 4 degree C |
| Thymidine | MP Biomedicals LLC | 103056 | Dissolved in sterile distiled water |
| Cdt1 siRNA | Life Technologies | Ref 10 | |
| Hec1 siRNA | Life Technologies | Ref 13 | |
| HeLa cells expressing GFP-H2B | |||
| HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B | Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan | ||
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich Corporation | F8775 | Toxic, needs caution |
| DAPI | Sigma-Aldrich Corporation | D9542 | Toxic, needs caution |
| Mouse anti-α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | Sc32293 | 1:1000 dilution |
| Rabbit ant-Zwint1 | Bethyl | A300-781A | 1:400 dilution |
| Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) | Upstate Biotechnology | 05-626, clone JBW301 | 1:300 dilution |
| Alexa 488 | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| Rodamine Red-X | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| BioLite 6 well multidish | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 35MM Glass bottom dish | MatTek Corporation | P35GCOL-1.5-14-C | |
| Nikon Eclipse TiE inverted microscope | Nikon Instruments | ||
| Spinning disc for confocal | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Ultra 888 EM-CCD Camera | Andor | iXon Ultra EMCCD | |
| 4 wave length laser | Agilent Technologies | ||
| Incubation System for Microscopes | Tokai Hit | TIZB | |
| NIS-elements software | Nikon Instruments |
References
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