Het combineren van de mitotische cel synchronisatie en hoge resolutie confocale microscopie om te bestuderen van de rol van multifunctionele celcyclus eiwitten tijdens de mitose
Summary
Presenteren we een protocol voor de dubbele thymidine synchronisatie van HeLa cellen gevolgd door analyse met behulp van hoge resolutie confocale microscopie. Deze methode is de sleutel tot het verkrijgen van groot aantal cellen die zich synchroon van S-fase naar mitose, studies over mitotische rollen van multifunctionele eiwitten die ook interfase functies bezitten inschakelen.
Abstract
Studie van de verschillende regelgevende gebeurtenissen van de celcyclus in een fase-afhankelijke manier biedt een duidelijk inzicht over celgroei en deling. De synchronisatie van cel populaties in specifieke stadia van de celcyclus is gevonden zeer nuttig in dergelijke experimentele inspanningen. Synchronisatie van cellen door behandeling met chemische stoffen die relatief minder giftig zijn kan nuttig zijn over het gebruik van farmacologische remmende geneesmiddelen voor de studie van de daaruit voortvloeiende celcyclus gebeurtenissen en specifieke verrijking van geselecteerde mitotische fasen te verkrijgen. Hier beschrijven we het protocol voor synchroniseren menselijke cellen in verschillende stadia van de cel cyclus, met inbegrip van zowel in S-fase en M fase met een dubbele thymidine blok en vrijgeven van de procedure voor het bestuderen van de functionaliteit van de mitotische eiwitten in chromosoom uitlijning en segregatie. Dit protocol is uiterst nuttig voor het bestuderen van de mitotische rollen van multifunctionele eiwitten die gevestigde interfase functies bezitten. In ons geval, kan de mitotische rol van Cdt1, een proteïne essentieel voor replicatie oorsprong licentieverlening in de G1-fase, effectief alleen wanneer G2/M-specifieke Cdt1 kan worden uitgeput worden bestudeerd. We beschrijven het gedetailleerd protocol voor uitputting van G2/M-specifieke Cdt1 met dubbele thymidine synchronisatie. We hebben ook uitleggen van het protocol van cel fixatie, en leven cel geschikt zijn met behulp van hoge resolutie confocale microscopie na thymidine release. De methode is ook handig voor het analyseren van de functie van de mitotische eiwitten onder zowel fysiologische en verontrust voorwaarden zoals Hec1, een onderdeel van het Ndc80 complex, omdat het een tot het verkrijgen van grote steekproeven van mitotische cellen voor vaste en levende cel in staat stelt analyse zoals we hier laten zien.
Introduction
In de celcyclus ondergaan cellen een aantal sterk gereguleerde en stoffelijk gecontroleerde gebeurtenissen voor de nauwkeurige duplicatie van hun genoom en proliferatie. Bij zoogdieren bestaat de celcyclus uit interfase en M-fase. In de interfase, die bestaat uit drie fasen – G1, S en G2, de cel duplicaten zijn genoom en ondergaat groei die nodig is voor de normale celcyclus progressie1,2. In de M-fase, die uit de mitose (profase, prometaphase, metafase, anafase, en telofase) en cytokinese bestaat, produceert een ouderlijke cel twee genetisch identieke dochtercellen. In de mitose, zuster chromatiden van gedupliceerde genoom zijn verkorte (profase) en op hun kinetochoren worden vastgelegd door de microtubuli van de geassembleerde mitotische spindel (prometaphase), drijft dat de uitlijning op de metafase-plaat (metafase), gevolgd door hun gelijk segregatie als zuster chromatiden zijn gesplitst naar en getransporteerd naar tegenovergestelde spindel palen (anafase). De twee dochtercellen worden fysiek gescheiden door de activiteit van een actine gebaseerde contractiele ring (telofase en cytokinese). De kinetochoor is een gespecialiseerde eiwithoudende structuur die in de centromeric regio van chromatiden assembleert en dienen als bijlage sites voor spindel microtubuli. Haar belangrijkste functie is te rijden van chromosoom vastleggen, uitlijning, en hulp bij het corrigeren van onjuiste spindel microtubulus bijlage, terwijl de spindel vergadering controlepost te handhaven van de trouw van het chromosoom segregatie3,4te bemiddelen.
De techniek van cel synchronisatie fungeert als een ideaal hulpmiddel voor het begrijpen van de molecuul- en structuurformule gebeurtenissen die betrokken zijn bij de celcyclus. Deze aanpak is gebruikt om te verrijken cel populaties in specifieke fasen voor verschillende soorten analyses, met inbegrip van profilering van genexpressie, analyses van cellulaire biochemische processen, en detectie van subcellular localisatie van eiwitten. Gesynchroniseerde zoogdiercellen kunnen worden gebruikt, niet alleen voor de studie van individuele genproducten, maar ook voor een aanpak met betrekking tot de analyse van hele genomen, met inbegrip van microarray analyse van gen expressie5, miRNA expressie patronen6, translationeel verordening7, en Proteoom analyse van eiwit wijzigingen8. Synchronisatie kan ook worden gebruikt voor het bestuderen van de effecten van genexpressie of eiwit knock-down of knock-out, of van chemische stoffen op de celcyclus.
Cellen kunnen worden gesynchroniseerd in de verschillende stadia van de celcyclus. Zowel de fysische en chemische methoden worden veel gebruikt voor de synchronisatie van de cel. De belangrijkste criteria voor synchronisatie van de cel zijn dat synchronisatie noncytotoxic en omkeerbaar moet. Vanwege de mogelijke negatieve cellulaire gevolgen cellen door farmacologische agenten te synchroniseren, kunnen afhankelijk van de chemische methoden nuttig zijn voor de studie van de celcyclus belangrijke gebeurtenissen. Bijvoorbeeld hydroxyurea, amphidicolin, mimosine en Lovastatine, kunnen worden gebruikt voor de synchronisatie van de cel in G1/S fase maar vanwege hun effect op de biochemische pathways, die ze remmen, ze activeren celcyclus checkpoint mechanismen en doden een belangrijke Fractie van de cellen9,10. Aan de andere kant, kan feedback remming van de DNA-replicatie door thymidine toe te voegen aan de groei-media, bekend als “thymidine blok”, de celcyclus op bepaalde punten11,12,13arresteren. Cellen kunnen ook worden gesynchroniseerd op G2/M fase door behandeling met nocodazole en RO-33069,14. Nocodazole, waardoor microtubulus vergadering, heeft een relatief hoge cytotoxiciteit. Bovendien kunnen nocodazole-gearresteerd cellen terug naar interfase precociously door mitotische ontsporing. Dubbele thymidine blok arrestatie cellen in G1/S fase en na vrijlating uit het blok cellen worden gevonden om door te gaan synchroon door G2 en in de mitose. De normale voortgang van de celcyclus voor cellen verlost van thymidine blok kan worden waargenomen onder hoge resolutie confocale microscopie door cel fixatie of levende imaging. Het effect van verstoring van de mitotische eiwitten kan worden bestudeerd specifiek wanneer cellen invoert en ga door mitose na vrijlating uit dubbele thymidine blok. Cdt1, een multifunctionele eiwit, is betrokken bij het DNA replicatie oorsprong licentieverlening in de G1-fase en is ook vereist voor kinetochoor microtubulus bijlagen tijdens de mitose15. Studeren de functie van Cdt1 tijdens de mitose, moet men een methode die het effect van de uitputting op replicatie licenties tijdens de G1-fase, terwijl tegelijkertijd het verrichten van de uitputting specifiek tijdens de G2/M fase alleen vermijdt te hanteren. Hier presenteren we gedetailleerde protocollen die zijn gebaseerd op de dubbele thymidine blok te bestuderen van de mitotische rol van eiwitten die meerdere functies tijdens verschillende stadia van de celcyclus door zowel vaste als live-cel imaging.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het belangrijkste voordeel van dubbele thymidine synchronisatie is bevat het een uitgebreide steekproef-grootte van mitotische cellen in een korte tijd venster met veel van deze cellen invoeren van mitose in unison, waardoor ook analyses van chromosoom uitlijning, bipolaire spindel vorming en scheiding van het chromosoom met een veel hoger rendement.
Vele regelgevende eiwitcomplexen en signaalroutes zijn gewijd aan het waarborgen van de normale progressie door middel van mitose en deregulering…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij zijn dankbaar aan Dr Kozo Tanaka van de Universiteit van Tohoku, Japan voor het delen van HeLa cellen stabiel uiting van mCherry-Histone H2B en GFP-α-tubuline. Dit werk werd gesteund door een subsidie van de NCI aan DV (R00CA178188) en start-up middelen van de Northwestern University.
Materials
| DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 degree C |
| DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 | Store at 4 degree C |
| Leibovitz’s (1X) L-15 medium | Life Technologies | 21083-027 | Store at 4 degree C |
| Serum reduced medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 319-85-070 | Store at 4 degree C |
| Penicillin and streptomycin | Life Technologies | 15070-063 (Pen Strep) | 1:1000 dilution |
| Dharmafect2 | GE Dharmacon | T-2002-02 | Store at 4 degree C |
| Thymidine | MP Biomedicals LLC | 103056 | Dissolved in sterile distiled water |
| Cdt1 siRNA | Life Technologies | Ref 10 | |
| Hec1 siRNA | Life Technologies | Ref 13 | |
| HeLa cells expressing GFP-H2B | |||
| HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B | Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan | ||
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich Corporation | F8775 | Toxic, needs caution |
| DAPI | Sigma-Aldrich Corporation | D9542 | Toxic, needs caution |
| Mouse anti-α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | Sc32293 | 1:1000 dilution |
| Rabbit ant-Zwint1 | Bethyl | A300-781A | 1:400 dilution |
| Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) | Upstate Biotechnology | 05-626, clone JBW301 | 1:300 dilution |
| Alexa 488 | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| Rodamine Red-X | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| BioLite 6 well multidish | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 35MM Glass bottom dish | MatTek Corporation | P35GCOL-1.5-14-C | |
| Nikon Eclipse TiE inverted microscope | Nikon Instruments | ||
| Spinning disc for confocal | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Ultra 888 EM-CCD Camera | Andor | iXon Ultra EMCCD | |
| 4 wave length laser | Agilent Technologies | ||
| Incubation System for Microscopes | Tokai Hit | TIZB | |
| NIS-elements software | Nikon Instruments |
References
- Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid. Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).
- Puck, T. T., Steffen, J. Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation. Biophys. J. 3, 379-392 (1963).
- Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).
- Musacchio, A., Desai, A. A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function. Biology (Basel). 6 (1), E5 (2017).
- Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases. Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).
- Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells. BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).
- Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. The translational landscape of the mammalian cell cycle. Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).
- Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly. J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).
- Coquelle, A., et al. Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis. Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).
- Amon, A. Synchronization procedures. Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).
- Cooper, S. Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis. Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).
- Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
- Vassilev, L. T., et al. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
- Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment. Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).
- Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. 5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells. Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).
- Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border. Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).
- Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2. Science. 297, 2267-2270 (2002).
- Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment. PLoS One. 12 (4), e0174819 (2017).
- Dou, Z., et al. Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).
- Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction. J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).
