Kombinere mitotisk celle synkronisering og høy oppløsning AC Confocal mikroskopi å studere rollen til multifunksjonelle celle syklus proteiner under mitose
Summary
Vi presenterer en protokoll for dobbel thymidine synkronisering av HeLa celler etterfulgt av analyse med høy oppløsning AC confocal mikroskopi. Denne metoden er nøkkelen til å få store antall celler som videre synkront fra S fasen til mitose, aktivere studier på mitotisk roller multifunksjonelle proteiner som har interphase funksjoner.
Abstract
Studien av forskjellige regulatoriske hendelsene i cellen syklus i en fase-avhengige måte gir en klar forståelse om cellevekst og deling. Synkroniseringen av celle populasjoner på bestemte stadier av celle syklus har funnet for å være svært nyttig i slike eksperimentelle bestrebelser. Synkronisering av celler av behandling med kjemikalier som er relativt mindre giftige kan være en fordel over bruken av farmakologiske hemmende narkotika for studiet av påfølgende celle syklus hendelser og hente bestemte anriking av valgte mitotisk stadier. Her beskriver vi protokollen for synkronisering menneskelige celler på ulike stadier av cellen syklus, inkludert både S fase og M fase med en dobbel thymidine blokk og slipp prosedyre for å studere funksjonaliteten til mitotisk proteiner i kromosom justering og segregering. Denne protokollen er svært nyttig for å studere mitotisk rollene multifunksjonelle proteiner som har etablert interphase funksjoner. I vårt tilfelle, kan mitotisk rollen som Cdt1, et protein som er kritiske for replikering opprinnelse lisensiering i G1 fase, studeres effektivt når G2/M-spesifikk Cdt1 kan bli tømt. Vi beskriver detaljert protokollen for uttømming av G2/M-spesifikke Cdt1 med doble thymidine synkronisering. Vi forklare protokollen for cellen fiksering, og live celle bildevisning høyoppløselig AC confocal mikroskopi etter thymidine. Metoden er også nyttig for å analysere funksjonen mitotisk proteiner under både fysiologiske og plaget forhold som for Hec1, en komponent i Ndc80 komplekset, som det gjør det mulig å få store utvalgene mitotisk celler for faste og levende celle analyse som vi viser her.
Introduction
I celle syklusen gjennomgå celler en rekke sterkt regulerte og timelig kontrollert hendelser for nøyaktig duplisering av sine genom og spredning. I pattedyr består celle syklus av interphase og M-fase. I interphase, som består av tre stadier – G1, S, og G2, cellen dubletter dens Genova og gjennomgår vekst som er nødvendig for normal celle syklus progresjon1,2. I M-fasen, som består av mitose (prophase, prometaphase, metaphase, anaphase og telophase) og cytokinesis, produserer en overordnet celle to genetisk identisk datter celler. Ved mitose, søster chromatids av dupliserte genom er knepet (prophase) og er fanget på deres kinetochores av piskehale som henger av sammensatte mitotisk spindelen (prometaphase), som driver justeringen på metaphase platen (metaphase) etterfulgt av deres lik segregering når søster chromatids er splittet mot og transportert til motsatt spindel polakker (anaphase). De to datter cellene er fysisk atskilt med aktiviteten til en utgangen-baserte kontraktile ring (telophase og cytokinesis). Kinetochore er en spesialisert proteinaceous struktur som samler på centromeric regionen chromatids og tjene som vedlegg nettsteder for spindel piskehale som henger. Dens viktigste funksjon er å kjøre kromosom fange, justering, og hjelpe til rette feil spindel microtubule vedlegg, mens formidling spindelen montering kontrollpunktet for å opprettholde gjengivelsen av kromosom segregering3,4.
Teknikken for celle synkronisering fungerer som et ideelt verktøy for å forstå molekylære og strukturelle hendelsene i cellen syklus progresjon. Denne tilnærmingen er brukt til å berike celle populasjoner i bestemte faser av ulike typer analyser, inkludert profilering av genuttrykk, analyser av mobilnettet biokjemiske prosesser og påvisning av subcellular lokalisering av proteiner. Synkroniserte pattedyrceller kan brukes ikke bare for studiet av personlige genet produkter, men også for tilnærminger som involverer analyse av hele genomer inkludert microarray analyse av gene expression5, miRNA uttrykk mønstre6, translasjonsforskning regulering7og proteomic analyse av protein modifikasjoner8. Synkroniseringen kan også brukes til å studere virkningene av genuttrykk eller protein sammenleggbare eller knock-out eller kjemikalier på cellen syklus progresjon.
Cellene kan synkroniseres på de ulike stadiene av celle syklus. Både fysiske og kjemiske er mye brukt for cellen synkronisering. De viktigste kriteriene for cellen synkronisering er at synkroniseringen skal noncytotoxic og reversibel. På grunn av potensielle negative mobilnettet konsekvensene av synkronisering celler av farmakologiske agenter, kan kjemisk-avhengige metoder være fordelaktig for å studere sentrale celle syklus hendelser. For eksempel hydroxyurea, amphidicolin, mimosine og lovastatin, kan brukes for cellen synkronisering på G1/S fase men, på grunn av deres effekt på biokjemiske veier de hemmer, de aktivere cellen syklus checkpoint mekanismer og drepe en viktig brøkdel av celler9,10. På den annen side, kan tilbakemeldinger hemming av utryddelse ved å legge thymidine til vekst medier, kjent som “thymidine blokken”, arrestere cellen syklus på enkelte punkt11,12,13. Cellene kan også synkroniseres på G2/M fase ved å behandle med nocodazole og RO-33069,14. Nocodazole, hvilke forhindrer microtubule montering, har en relativt høy cytotoksisitet. Videre nocodazole-arrestert celler kan gå tilbake for å interphase precociously av mitotisk glidning. Dobbel thymidine blokk arrestasjonen celler på G1/S fase og etter utgivelsen fra blokken, celler er funnet for å fortsette synkront gjennom G2 og mitose. Normal progresjon av cellen syklus for cellene utgitt av thymidine kan observeres under høy oppløsning AC confocal mikroskopi celle fiksering eller live bildebehandling. Effekten av forstyrrelsene mitotisk proteiner kan studeres spesielt når cellene inn og Fortsett gjennom mitose etter utgivelsen av dobbel thymidine. Cdt1, en multifunksjonell protein, er involvert i DNA replikering opprinnelse lisensiering i G1 fase og er også nødvendig for kinetochore microtubule vedlegg under mitose15. For å studere funksjonen til Cdt1 under mitose, trenger man å vedta en metode som unngår effekten av sin uttømming på replikering lisensiering i G1 fasen samtidig påvirker sin uttømming spesielt i G2/M fasen bare. Her presenterer vi detaljerte protokoller basert på dobbel thymidine blokken å studere mitotisk rollen av proteiner utføre flere funksjoner i ulike stadier av celle syklus av både faste og live-celle tenkelig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den viktigste fordelen med doble thymidine synkronisering er at det gir en økt utvalgsstørrelsen mitotisk celler i et kort tidsvindu med mange av disse cellene inn mitose unisont, dermed muliggjør også analyser av kromosom justering, bipolar vri dannelse og kromosom segregering med mye høyere virkningsgrad.
Mange regulatoriske protein komplekser og signalveier er viet til å sikre normal fremdrift gjennom mitose og dereguleringen av denne prosessen kan førte til tumorigenesis. Live celle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige for Dr. Kozo Tanaka Tohoku University, Japan for deling HeLa celler uttrykke stabilt mCherry-Histone H2B og GFP-α-tubulin. Dette arbeidet ble støttet av en NCI tilskudd til DV (R00CA178188) og oppstart midler fra Northwestern University.
Materials
| DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 degree C |
| DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 | Store at 4 degree C |
| Leibovitz’s (1X) L-15 medium | Life Technologies | 21083-027 | Store at 4 degree C |
| Serum reduced medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 319-85-070 | Store at 4 degree C |
| Penicillin and streptomycin | Life Technologies | 15070-063 (Pen Strep) | 1:1000 dilution |
| Dharmafect2 | GE Dharmacon | T-2002-02 | Store at 4 degree C |
| Thymidine | MP Biomedicals LLC | 103056 | Dissolved in sterile distiled water |
| Cdt1 siRNA | Life Technologies | Ref 10 | |
| Hec1 siRNA | Life Technologies | Ref 13 | |
| HeLa cells expressing GFP-H2B | |||
| HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B | Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan | ||
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich Corporation | F8775 | Toxic, needs caution |
| DAPI | Sigma-Aldrich Corporation | D9542 | Toxic, needs caution |
| Mouse anti-α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | Sc32293 | 1:1000 dilution |
| Rabbit ant-Zwint1 | Bethyl | A300-781A | 1:400 dilution |
| Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) | Upstate Biotechnology | 05-626, clone JBW301 | 1:300 dilution |
| Alexa 488 | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| Rodamine Red-X | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| BioLite 6 well multidish | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 35MM Glass bottom dish | MatTek Corporation | P35GCOL-1.5-14-C | |
| Nikon Eclipse TiE inverted microscope | Nikon Instruments | ||
| Spinning disc for confocal | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Ultra 888 EM-CCD Camera | Andor | iXon Ultra EMCCD | |
| 4 wave length laser | Agilent Technologies | ||
| Incubation System for Microscopes | Tokai Hit | TIZB | |
| NIS-elements software | Nikon Instruments |
References
- Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid. Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).
- Puck, T. T., Steffen, J. Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation. Biophys. J. 3, 379-392 (1963).
- Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).
- Musacchio, A., Desai, A. A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function. Biology (Basel). 6 (1), E5 (2017).
- Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases. Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).
- Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells. BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).
- Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. The translational landscape of the mammalian cell cycle. Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).
- Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly. J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).
- Coquelle, A., et al. Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis. Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).
- Amon, A. Synchronization procedures. Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).
- Cooper, S. Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis. Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).
- Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
- Vassilev, L. T., et al. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
- Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment. Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).
- Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. 5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells. Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).
- Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border. Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).
- Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2. Science. 297, 2267-2270 (2002).
- Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment. PLoS One. 12 (4), e0174819 (2017).
- Dou, Z., et al. Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).
- Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction. J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).
